Introduction
Streptococcus pneumoniae, um colonizador comum da comunidade polimicrobiana da nasofaringe, é capaz de competir com outros pneumococos e espécies estreitamente relacionadas com a produção de peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias (bacteriocinas). Cada cepa de pneumococo totalmente sequenciado examinado até o momento contém uma versão do b acteriocin- l ike lócus p eptide, blp. Produção de bacteriocina por pneumococos foi demonstrada ser importante no resultado de estudos in vitro e in vivo em competição 1-4. Dinâmica competitiva são influenciados pela expressão de diversas proteínas de bacteriocinas, juntamente com imunidade cognatos em resposta a uma feromona de péptido específico. Indução do locus blp é controlada por um sistema de sensor de quorum na qual um péptido de feromonas, BLPC, liga-se ao sensor de quinase, BlpH, e inicia uma cascata de sinalização que resulta em otranscrição do locus de 5,6 blp. Existem quatro variantes alélicas BLPC que se ligam a cada um o seu cognato BlpH 6. Para a célula sobreviver os efeitos da sua própria bacteriocina, os genes que codificam as proteínas cognatas imunidade são transcritos no mesmo operão como cada um dos genes de bacteriocina. Matar ocorre se uma estirpe de competidor não é capaz de regular positivamente o locus blp em resposta a feromona exógena ou, se a estirpe não tem o gene da imunidade específica é necessária para a protecção. O complexo transportador, BlpAB é necessário para a secreção e processamento do péptido de feromona e dos péptidos de bacteriocina 2,4. Recentemente, tem sido demonstrado que uma proporção significativa de cepas de pneumococo são "trapaceiros", que significa que eles têm uma mutação no gene conservado BLPA que os torna incapazes de secretar feromônios e bacteriocinas 1,2. Essas cepas são capazes de responder a BLPC exógena 2 secretado pelo relincharestirpes chatas que permitem a produção de proteínas de imunidade.
Embora, preparações cruas de bacteriocinas de sobrenadantes podem ser preparados a partir de estirpes produtoras utilizando métodos bioquímicos passos para alcançar a pureza, esta abordagem não é útil para o rastreio de grandes colecções de isolados e, se o nível de expressão é baixo bacteriocina em caldo de culturas cultivadas 2,7- 9. O ensaio de sobreposição é usada como uma forma rápida para investigar a dinâmica da concorrência entre as linhagens que podem existir in vitro. Para isso, uma estirpe de pneumococos é pré-inoculado em uma placa de agar e deixadas a crescer até atingir concentrações bacterianas locais suficientes para a indução do locus blp. Uma segunda estirpe é inoculada em seguida uma solução de agar mole fundido, que é então aplicada sobre a tensão pré-inoculado para testar a sensibilidade. Para avaliar a actividade do locus blp (independente da actividade inibidora), as estirpes podem ser cobertos com uma série de three linhagens descritas anteriormente repórter BLPC. Essas linhagens foram construídos para conter um dos três alelos blpH diferentes que respondem a três feromônios BLPC mais comuns secretados pelo pneumococo. As estirpes de repórter tem um gene lacZ integrada, que está sob o controlo de um promotor dependente BlpH e transportar uma deleção no gene BLPC que impede a auto-estimulação 10,11.
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Protocol
1 Preparação da Estirpe Produtor
- Streak uma cepa de pneumococo a ser testado para a produção de bacteriocina em sangue de carneiro soja tríptica placa de ágar de 5% a partir de -80 ° C stocks congelador.
NOTA: A utilização de placas de sangue para o crescimento inicial da estirpe para ser testado para a inibição aumenta enormemente a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, outras estirpes não pneumococos que produzem bacteriocinas pode ser usada, embora as condições de crescimento podem ter de ser modificados para um organismo específico. Usámos o Streptococcus mitis e Lactococcus lactis no ensaio de sobreposição com sucesso. - Incubar a placa durante a noite (O / N) a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Após a incubação da estirpe produtora, preparar a placa de agar de tripticase de soja (TSA), pipetando 3000 a 4000 unidades de catalase em placas contendo 25 mL de TSA e espalhar a solução de catalase usando esferas de vidro estéreis. Deixe a placa secar durante cerca de 10 minutos, sobuma cabine de segurança biológica.
- Colete uma quantidade visível de bactérias em uma ponta da pipeta. Esfaquear a ponta da pipeta na placa de TSA seco.
NOTA: Mais de uma cepa produtora pode ser esfaqueado em uma única placa de TSA. É importante para o espaço fora dos golpes de modo que halos resultantes não se sobreponham.- Se possível, incluem os conhecidos produtor de bacteriocina, como um controlo positivo e a estirpe para ser usado na camada como um controlo negativo.
NOTA: Os controlos positivos e negativos são têm sido publicados anteriormente e estão disponíveis mediante solicitação 10.
- Se possível, incluem os conhecidos produtor de bacteriocina, como um controlo positivo e a estirpe para ser usado na camada como um controlo negativo.
- Incubar a placa de TSA contendo múltiplos golpes, a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 6 horas.
2. Fazer Stocks glicerol da estirpe Overlay
- Preparar stocks de glicerol (culturas crescidas até à fase semi-exponencial e em seguida armazenadas a -80 ° C após a adição de glicerol) antes do dia do ensaio de sobreposição. Inocular 5-10 colônias de str pneumocócicaain a ser testada para a sensibilidade ou a secreção de feromonas em meio Todd-Hewitt com extracto de levedura 0,5% (THY).
NOTA: Construção de BLPC repórteres induzíveis foi previamente descrito 2 e cepas estão disponíveis mediante solicitação. - Incubar 5-10 colônias em tubos de vidro com 5 ml de THY com tampas hermeticamente fechado em C banho de água 37 °, sem tremer.
- Incubar as culturas a 37 ° C até atingir uma OD 620 de 0,3 a 0,5.
NOTA: Isso levará cerca de 4-5 horas, dependendo da estirpe utilizada.- Inverta suavemente o tubo algumas vezes antes de medir o OD.
- Se a experiência não pode ser realizada no mesmo dia ou a tensão irá ser usado várias vezes no futuro, fazer stocks de glicerol e retomar o experimento em data posterior. Para as unidades populacionais de glicerol, glicerol adicionar às culturas a uma concentração final de 20%. Culturas Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. NOTA: As amostras podem ser stored para meses a -80 ° C. Se não fazer estoques de glicerol, utilize amostras diretamente para o ensaio de sobreposição.
3. Assay Overlay
- Pouco antes de sobrepor aplicação, misturar os componentes de sobreposição. Em um tubo de 15 ml, adicionar 5 ml de THY, 3000-4000 U de catalase, e 200 mL do caldo de cultura sobreposição de tensão que tanto cresceu naquele dia ou um estoque de glicerol da cultura que foi descongelado à temperatura ambiente. Se utilizar a estirpe repórter, adicionar 50 ul de X-gal (40 mg / ml) para a mistura de sobreposição. Use um tubo cônico por placa.
- Equilibrar mistura de sobreposição à temperatura ambiente antes da adição de TSA fundido.
- Retire a placa de TSA com tensão esfaqueado por incubadora. Derreta TSA sólido em microondas e manter a 55 ° C banho-maria até que esteja pronto para uso. Adicione 3 mL de TSA fundido com 1,5% de agar arrefecida a 55 ° C para se sobrepor mistura.
- Preparar a mistura de revestimento imediatamente antes de pipetar, a mistura começa a solidificar muitorapidamente. NOTA: Se a máscara começa a solidificar antes de chapeamento, os resultados serão uninterpretable.
- Misturar a mistura de sobreposição por pipetagem para cima e para baixo várias vezes com 5 ml de uma pipeta tendo o cuidado de não introduzir bolhas na mistura. Lentamente pipeta mistura sobreposição diretamente sobre a placa de TSA esfaqueado. Manter a placa na bancada durante alguns minutos, permitindo que o agar endurecer.
- Não rode a placa para distribuir a mistura de sobreposição, isso vai puxar o crescimento da cultura esfaqueado na sobreposição.
- Coloque cuidadosamente placa de TSA com sobreposição em 37 ° C incubadora contendo 5% de CO 2 O / N (cerca de 16-18 h).
- Observar as placas após o crescimento durante a noite. As placas devem aparecer opaco do crescimento da sobreposição de tensão, exceto em áreas onde tenha ocorrido inibição ou feromônio sinalização. Estes aparecem como zonas ou claros ou azuis ao redor da cepa esfaqueado, respectivamente.
NOTA: Embora measurements do diâmetro da clareira azul ou pode ser determinada por avaliação quantitativa, as diferenças no diâmetro pode também variar dependendo da quantidade de bactérias que foi rapidamente na placa. O ensaio de sobreposição é um ensaio qualitativo, qualquer avaliação quantitativa devem ser interpretados com cautela. Qualquer compensação visível em comparação com o controlo negativo é considerado como actividade.
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Representative Results
Há dois resultados possíveis no ensaio de sobreposição. Deve ser possível ver o crescimento da estirpe esfaqueado após incubação durante a noite. Na Figura 1A, a sobreposição estirpe é sensível para as bacteriocinas que são produzidos. A zona livre pode ser visualizada em torno da tensão esfaqueado. Além disso, a roda da estirpe esfaqueado na mistura de revestimento é possível e pode ser visto na figura 1A. Na Figura 1B, a sobreposição estirpe é imune às bacteriocinas sendo secretados como observado por uma ausência de um halo em torno do golpe. É também possível que a estirpe não é esfaqueado secretoras bacteriocinas. Para o ensaio de sinalização, dois resultados diferentes são possíveis. A estirpe é capaz de esfaqueado secretam feromona que interage com a histidina quinase da sobreposição da tensão, como visto através da repartição de X-gal, como mostrado na Figura 2A. Se a feromona não activa a transcrição dolócus blp na estirpe repórter, ou se a estirpe esfaqueado não secretam feromona, desagregação de X-gal não irá ocorrer, como mostrado na Figura 2B.
Figura 1 Aspecto de blp mediada inibição e imunidade em um ensaio de sobreposição. (A) A estirpe P133, um produtor de bacteriocina foi cravado numa placa de TSA e deixadas a crescer durante seis horas. P250 Strain, uma cepa bacteriocina negativo, foi inoculado em sobreposição. As placas foram fotografadas após S / N de incubação. A zona de folga é indicado pela seta. (B) Estirpe P133 foi misturado numa placa de TSA e incubados durante 6 horas. Estirpe 130, que contém uma mutação de frameshift no BLPA, inoculou-se a sobreposição. Depois de O / N de incubação, as placas foram fotografadas.
Figura 2 Feromônio mediada ativação do locus blp na sinalização ensaio. (A) A estirpe P133, um tipo BLPC R6 secretor, foi misturado numa placa de TSA e incubados durante 6 horas. P981 Strain, um tipo BLPC R6 repórter com uma deleção no BLPC, foi inoculado em sobreposição. Fotografias foram tiradas depois de O / N incubação. (B) P133 foi cravado em uma placa de TSA. Após a incubação durante 6 horas, P845, um repórter tipo P164 BLPC com uma deleção no BLPC, foi inoculado em sobreposição. Fotografias foram tiradas depois de O crescimento / N.
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Discussion
Este ensaio sobreposição é uma maneira rápida para determinar o leque de actividades para os produtores de bacteriocinas e demonstrar interações competitivas que podem ocorrer entre cepas de pneumococo. O ensaio de sobreposição pode ser adaptado para ser usado para o rastreio de várias estirpes de produção de bacteriocina, numa única placa. Temos rastreados com sucesso de grandes colecções de deformação com este ensaio, utilizando um replicador de 48 pinos para inocular placas de SBA de uma metade de uma placa de 96 poços. Após incubação durante a noite, o crescimento é transferido para a placa de TSA com o replicador e perfurar a superfície da placa de agar com os pinos do replicador.
Outros peptídeos antimicrobianos bactérias secretadas que são regulados de maneira dependente de densidade como lantibióticos também pode ser analisado através da técnica de sobreposição de 7,12,13. Isto é especialmente útil quando a purificação de uma bacteriocina ou lantibiótico é difícil. Embora os sobrenadantes podem ser testados para antimicrobianaactividade, a expressão dos derivados BLP bacteriocinas em caldo é muito limitada ou inexistente (dados não mostrados). O ensaio permite a sobreposição de crescimento a uma densidade mais elevada, que não é atingida quando os organismos são cultivadas em líquido. Crescimento em meio sólido também pode refletir mais de perto as condições in vivo de crescimento da nasofaringe.
O ensaio de sobreposição também pode ser usado para examinar a capacidade da estirpe esfaqueado secretar a feromona sinalização específica bacteriocina. Isto requer a construção de uma estirpe repórter que expressa a proteína do receptor de feromonas e em que um promotor responsivo a feromonas é colocado a montante do gene lacZ. Avaliação da secreção de feromonas de uma estirpe esfaqueado é particularmente útil como uma leitura da actividade loco blp se a estirpe esfaqueado não inibe a sobreposição estirpe. A incapacidade para inibir a estirpe de sobreposição poderiam ser o resultado de um locus blp não funcionais (tal como numacoe com uma mutação transportador) ou porque as bacteriocinas secretadas não são ativas contra a estirpe particular de sobreposição testado. A sobreposição repórter tensão fornece informações adicionais que o lugar em que o produtor possua um transportador totalmente funcional sistema de dois componentes e BLPA permitindo a regulação positiva e secreção de feromônio. Isto implica que quaisquer bacteriocinas codificados também são secretadas.
Existem algumas limitações para este ensaio. O ensaio de sobreposição é um teste qualitativo, de forma a comparação entre a actividade inibidora de secreção de feromonas ou de diferentes estirpes tem que ser feita com cuidado. Preços e condições de crescimento devem ser considerados quando se comparam diferentes cepas, porque o resultado do ensaio depende muito da taxa de crescimento da sobreposição e cepas esfaqueado. A adição de catalase para ambos o prato e a sobreposição é importante, a fim de eliminar os efeitos inibitórios do pneumococo de H 2 O 2 na produçãocrescimento da sobreposição de tensão, em particular quando se utiliza catalase organismo negativo na sobreposição. Dada a diversidade de conteúdo genómico conhecido na população pneumocócica, qualquer actividade inibitória observada com este ensaio não pode ser automaticamente atribuído ao locus blp sem análise de deleção.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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