Summary
बड़ी पहचान (न्यूरॉन्स के साथ पशुओं में
Protocol
1. रिकॉर्डिंग डिश तैयार
- बल transducer प्रयोगों के दौरान, मुख गंग्लिया, सेरेब्रल नाड़ीग्रन्थि, और मुख जन एक दौर Pyrex पकवान कि बल के अध्ययन के लिए विशेष है में रखा जाता है.
- प्रयोगों में डालने वाला तरह पैटर्न को प्रेरित करने के लिए, हम मस्तिष्क 15 नाड़ीग्रन्थि गैर hydrolyzable cholinergic agonist carbachol लागू करने की जरूरत है. मुख ganglia और मुख जन पर carbachol से सीधे संपर्क से बचने के लिए, अलग कक्षों मुख ganglia और मुख द्रव्यमान (1 चित्रा) से मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि को अलग करने की जरूरत है.
- चूंकि मुख जन मुख ganglia से ज्यादा गहरा हो जाता है, वे एक ही स्तर पर नहीं रखा जाएगा. इसलिए, इस पकवान मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि के लिए एक वापस चैम्बर (क्षेत्र में एक चित्रा 1), मुख (1 चित्रा में क्षेत्र सी) ganglia, और मुख जन के लिए एक बहुत गहरी सामने कक्ष के लिए एक मध्यम मंच (क्षेत्र विकास में
- इस पकवान बनाने के लिए, एक दौर 100x15 Pyrex पकवान (15 मिमी उच्च, व्यास में 100 मिमी) के साथ शुरू करते हैं. पकवान के निर्माण की आवश्यकता होगी Sylgard के कई pours. Sylgard उत्पाद के साथ दिए गए निर्देशों का पालन करें. Sylgard अलग pours के बीच स्थापित करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए.
- 1 डालना (1 चित्रा में क्षेत्र बी) पकवान, जो मध्यम मंच और वापस कक्ष के बीच दीवार में Sylgard के उच्चतम स्तर बनाने के लिए है.
- दो क्ले मॉडलिंग backings प्रयोग Sylgard दीवार (1 चित्रा में क्षेत्र बी) के लिए क्षेत्र को अलग करने के लिए. कोट प्लास्टिक की चादर के साथ क्ले मॉडलिंग backings जहां वे आसानी से हटाने के लिए Sylgard संपर्क करेंगे. किनारों पर तंग जवानों को सुनिश्चित करने के लिए, जहां क्ले मॉडलिंग पकवान संपर्क, रिसाव को कम कर देंगे.
- दो क्ले मॉडलिंग backings के बीच लगभग पकवान के शीर्ष भाग में Sylgard डालो. चलो पूरी तरह रातोंरात सेट Sylgard. एक गर्म स्थान में रखते हुए पकवान प्रेरित करेगातेजी से स्थापित है. क्ले मॉडलिंग backings निकालें और Sylgard पर किसी भी मिट्टी के अवशेषों को साफ.
- अगला, वापस (क्षेत्र में एक चित्रा 1) कक्ष और मध्यम मंच (1 चित्रा में क्षेत्र सी) डाला जाना चाहिए.
- 5 मिमी के बारे में क्ले मॉडलिंग समर्थन के बीच मंच के अनुभाग क्षेत्र (सी) के लिए Sylgard के सामने की सतह से दूर रखें.
- वापस क्षेत्र (ए) कक्ष और मध्य 1 Sylgard दीवार क्षेत्र (बी) के शीर्ष स्तर से नीचे लगभग 3-5 मिमी की ऊंचाई मंच क्षेत्र (सी) के लिए वर्गों में Sylgard डालो. वापस चैम्बर के Sylgard सतह थोड़ा बीच वापस बीच मंच के लिए carbachol युक्त कक्ष से रिसाव से बचने के मंच की तुलना में कम होना चाहिए. फिर, Sylgard पूरी तरह रातोंरात सेट और फिर क्ले मॉडलिंग समर्थन निकालें.
- अंतिम चरण के लिए Sylgard दीवार के बीच में एक पायदान में कटौती करने के लिए मस्तिष्क मुख connectives के लिए एक चैनल (CBCs) के लिए जाना हैके माध्यम से मध्यम मंच और वापस कक्ष के बीच. इस निशान की चौड़ाई लगभग 3-4 मिमी, है जो विस्तृत CBCs के लिए पर्याप्त है होना चाहिए. पायदान की नीचे बीच के रिसाव को रोकने के लिए एक मंच के Sylgard सतह से कम नहीं होना चाहिए. एक स्केलपेल ब्लेड पायदान में कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. इलेक्ट्रोड तैयारी
- एकल बैरल केशिका गिलास 3.1 अनुभाग में एक ज्वलंत ब्राउन micropipette McManus एट अल द्वारा वर्णित डांड़ी 8 उपयोग से बाह्य कांच इलेक्ट्रोड खींचो. डांड़ी में FT345B रेशा के साथ, हमारे ठेठ कार्यक्रम सेटिंग्स हीट 480, 50 खींचो, वेग 13, और 20 समय कर रहे हैं, लेकिन कृपया ध्यान दें कि सेटिंग filaments के लिए अलग अलग हो जाएगा. इस कार्यक्रम के एक एकल खींचने में कोई मंच आग चमकाने के साथ इलेक्ट्रोड बनाता है. इलेक्ट्रोड टिप के आकार के सेल शरीर के आकार की तुलना में छोटा होना चाहिए. 50 सुक्ष्ममापी से सोम व्यास, आंतरिक diamete में 400 सुक्ष्ममापी लेकर मोटर न्यूरॉन्स के लिएबाह्य कांच इलेक्ट्रोड के रुपये के बारे में 40 सुक्ष्ममापी हो और उनके resistances 0.1 MΩ के बारे में होना चाहिए जब वे Aplysia नमक के साथ भर रहे हैं चाहिए.
- एक लैम्प बर्नर का उपयोग polyethylene टयूबिंग से चूषण इलेक्ट्रोड खींचो. Polyethylene टयूबिंग की एक टुकड़ा के बारे में 10 सेमी लंबा कट. दोनों सिरों पर ट्यूबिंग पकड़ो और यह जगह बहुत लैम्प बर्नर द्वारा उत्पन्न लौ को करीब जबकि ट्यूब घूर्णन जब तक यह गर्मी से नरम हो जाता है. टयूबिंग ध्यान से इसकी लंबाई के साथ मांसपेशियों को जबकि यह लौ से दूर जा रहा है. टयूबिंग के मध्य भाग को बढ़ाना और संकीर्ण टयूबिंग के रूप में खींच लिया है.
- आधे में टयूबिंग काट दो चूषण इलेक्ट्रोड फार्म. सक्शन इलेक्ट्रोड आम तौर पर नसों या मांसपेशियों की कटौती छोर तक लागू कर रहे हैं, हालांकि वे कभी कभी Passant एन लागू किया जा सकता है.
- तंत्रिका 3.2-3.13 वर्गों में McManus एट अल 8 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के बाद रिकॉर्डिंग के लिए हुक इलेक्ट्रोड बनाएँ. ये इलेक्ट्रोड especiउपयोगी सहयोगी जब एक तंत्रिका या मांसपेशी काट नहीं है.
3. हुक इलेक्ट्रोड अनुलग्नक
- पशु काटना और McManus एट अल में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद मुख जन को दूर 8 4 अनुभाग.
- रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए, हुक इलेक्ट्रोड विभिन्न नसों की एक संख्या से जुड़ा जा सकता है.
- विशेषताएँ पैटर्न के रूप में vivo में Cullins और Chiel 9 द्वारा किया गया था, रिकॉर्डिंग I2 तंत्रिका और मांसपेशी कि 16 खिलाने के अतिकाल चरण, radular तंत्रिका (आर एन) कि भोजन के बंद होने के 17 grasper, मुख का संकेत इंगित करता है से प्राप्त किया जाना चाहिए 2 तंत्रिका (BN2) और मुख 3 तंत्रिका (BN3) है कि त्याग 17,18 चरण से संकेत मिलता है. हुक इलेक्ट्रोड के अनुलग्नक McManus एट अल 8, धारा 5 के द्वारा वर्णित है कि इसी तरह की प्रक्रिया के बाद.
- इन नसों के स्थानों Aplysia खिला तंत्र के योजनाबद्ध में दिखाया देखेंMcManus एट अल 8 चित्रा 2. ध्यान दें कि क, ख, और पार्श्व नाली में I1 मांसपेशी के नीचे जाने से पहले सी शाखाओं में BN2 trifurcates. शाखा मुख्य ट्रंक से अलग करने के लिए एक 1 शाखा है, और BN3 करने के लिए आसन्न है.
- एक शाखाओं का नामकरण, ख और ग Warman और Chiel 18 द्वारा इस्तेमाल किया गया था. शाखाओं एक, ख, ग और 3, 2 शाखाओं के अनुरूप है, और 1, क्रमशः, Nargeot एट अल द्वारा इस्तेमाल किया नामकरण में 19. इसके अलावा, आर.एन. BN1, BN2, और BN3 नसों 1, 6, 5 के अनुरूप है, और 4, क्रमशः, कंडेल 20 और स्कॉट एट अल द्वारा इस्तेमाल नामकरण में 21.
- I1/I3 मांसपेशी की मांसपेशी innervation अध्ययन करने के लिए, मुख नसों को छोड़कर सभी नसों 2 प्रयोगों के दौरान मुख जन से कटे जाएगा. इस प्रकार, हम एक हुक इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल BN2 से रिकॉर्ड. <li> चूंकि I2 तंत्रिका और आर.एन. मुख बड़े पैमाने पर करने के लिए संलग्न नहीं होगा, और वे बहुत हुक इलेक्ट्रोड का उपयोग का उपयोग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं, यह चूषण इलेक्ट्रोड को लागू करने के बजाय उन लोगों से रिकॉर्ड करने के लिए बेहतर है. हम धारा 7 में चूषण इलेक्ट्रोड के आवेदन का वर्णन होगा.
- या तो एक हुक इलेक्ट्रोड या एक चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए BN3 से रिकॉर्ड करने के लिए, क्योंकि यह इलेक्ट्रोड के दोनों तरह का उपयोग का उपयोग करने के लिए आसान है. हम BN3 रिकॉर्डिंग के लिए एक हुक इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए चूषण इलेक्ट्रोड रखने के लिए manipulators की संख्या को कम करने के लिए, और अन्य manipulators या उपकरण के लिए अंतरिक्ष को बचाने के लिए चुना.
- एक हुक इलेक्ट्रोड संलग्न BN2 (BN2 एक) की एक प्रयोगों के दौरान अस्वीकृति की तरह पैटर्न को आरंभ करने के लिए शाखा. यह उपयोगी है दूसरी तरफ BN2 एक एक अतिरिक्त हुक इलेक्ट्रोड देते हैं, क्योंकि कुछ न्यूरॉन्स ipsilateral बनाम contralateral BN2 उत्तेजना के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया.
- करने के लिए मदद एकतरफा बनाम द्विपक्षीय अनुमानों के साथ न्यूरॉन्स भेद,मुख ganglia के दूसरे पक्ष पर भी उपयोगी है BN2 और BN3 हुक इलेक्ट्रोड देते.
4. Ganglia और स्नायु तैयारी
- मुख ganglia, मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि और मुख जन बल transducer प्रयोगों के लिए तैयार हो जाएगा, जो मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि और केवल BN2s माध्यम CBCs मुख जन मुख ganglia से जुड़ा हुआ है के माध्यम से मुख ganglia से जुड़ा हुआ है.
- हुक इलेक्ट्रोड संलग्न करने के बाद, मुख 1 तंत्रिका (BN1) और esophageal (एन) द्विपक्षीय स्तर पर तंत्रिका कटौती, लगाव बिंदु पर मुख जन को काटने.
- I2 मांसपेशी के रास्ते से बाहर स्थानांतरित करने के लिए मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि आगे खींचो. I2 मांसपेशी में radular थैली पर एक कट, कट laterally और पूर्व से दोनों दिशाओं में विस्तार, और I2 आगे मांसपेशियों करने के लिए radular तंत्रिका बेनकाब प्रालंब खींच. दो आर.एन. शाखाओं काटें और यकीन है कि शाखाओं चूषण इलेक्ट्रोड लगाव के लिए लंबे समय के लिए पर्याप्त हैं.
- सीजारी रखें मुख ganglia के चारों ओर एक विस्तृत सर्कल में I2 कटौती के लिए BN2s या BN3s में कटौती नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है, जब तक मुख ganglia और I2 मांसपेशी के संलग्न हिस्सा पूरी तरह से मुख जन से अलग किया जा सकता है. मुख बड़े पैमाने पर करने के लिए लगाव बिंदु पर द्विपक्षीय BN3s हुक इलेक्ट्रोड लगाव परे, काटें.
- रिकॉर्डिंग कि वापस चैम्बर और मध्यम मंच से जोड़ता है ऊपर वर्णित पकवान में पायदान वैक्यूम तेल की एक पतली परत लागू करने के लिए, एक विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए वैक्यूम तेल के एक glob लेने और यह पायदान पर फैला.
- सामने चैम्बर जहां मुख जन रखा जाएगा गिलास नीचे के बीच मंच के Sylgard आधार के सामने बस में त्वरित जेल सुपर गोंद की एक पतली परत लागू करें.
- ध्यान से रिकॉर्डिंग (1 चित्रा) पकवान धारा 2 में वर्णित मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि, मुख ganglia और मुख जन हस्तांतरण, यकीन है कि हुक इलेक्ट्रोड का कोई भी कसकर खींच रहे हैं, जो तंत्रिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है.
- ध्यान से गोंद पर रिकॉर्डिंग डिश के सामने चैम्बर में मुख जन जगह करने के लिए सुनिश्चित करें कि अपनी उदर सतह पकवान के नीचे करने के लिए सरेस से जोड़ा हुआ है. Ganglia और गोंद छूने से इलेक्ट्रोड रखना सुनिश्चित करें. पकवान Aplysia 8 खारा (460 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, 22 मिमी 2 MgCl, 33 मिमी MgSO 4, 10 मिमी 2 CACL, 10 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी MOPS, पीएच 7.4-7.5) जोड़ें, जो गोंद प्रेरित करेगा सेट करने के लिए.
- यदि पकवान कोशिकी सोमा रिकॉर्डिंग के लिए मुख ganglia की तैयारी के लिए एक और माइक्रोस्कोप स्थानांतरित किया जाना चाहिए, हुक इलेक्ट्रोड के साथ बहुत सावधान रहना. समूह मुख द्रव्यमान का एक पक्ष पर एक साथ इलेक्ट्रोड, और भी मुख द्रव्यमान का एक साथ दूसरे पक्ष पर इलेक्ट्रोड समूह. ध्यान से प्रयोगशाला टेप है कि संबंधक पिन शामिल लोभी द्वारा इलेक्ट्रोड पकड़, फिर यकीन है कि इलेक्ट्रोड का कोई भी कसकर खींच रहे हैं.
- जब पकवान माइक्रोस्कोप, इलेक्ट्रोड के तहत तैनात हैएस पकवान और पकवान के बगल में मंच पर बाकी के पक्षों पर धीरे लिपटी चाहिए.
- ब्रेक के दौरान और प्रयोग के चरणों के बीच, मुख जन एक मछलीघर airstone का उपयोग कर कक्ष में खारा aerate.
- संदंश का प्रयोग मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि की म्यान हड़पने के लिए और इसे वापस चेंबर में खींच, यह सुनिश्चित करना है कि CBCs पायदान के माध्यम से चलाने के. मस्तिष्क CBCs के अलावा अन्य नसों का उपयोग बरकरार CBCs को नुकसान से बचने के नाड़ीग्रन्थि पिन.
- अधिक CBCs पर वैक्यूम तेल लागू करें, और तब पकवान के दोनों कक्षों अधिक Aplysia खारा जोड़ने के लिए है, इसलिए कि ganglia पूरी तरह से डूबे हुए हैं. सुनिश्चित करें कि वैक्यूम तेल के शीर्ष Sylgard दीवार से थोड़ा अधिक है ताकि कोई रिसाव कोठरियों के बीच घटित होगा.
- मुख ganglia को स्थिर करने के लिए, 1 BN3s, तो बीच मंच (2 चित्रा) के Sylgard आधार पर और BN1s Ens के सिरों पिन. चूंकि BN3s हुक इलेक्ट्रोड का उपयोग कर दर्ज किया जाएगा, पिन हुक इलेक्ट्रोड के लगाव अंक की तुलना में अधिक distally रखा जाना चाहिए.
- दो पिनों का उपयोग करने के लिए, 90 डिग्री तुला, के रूप में खिंचाव और CBCs लंगर, तो यह है कि CBCs (2 चित्रा) नहीं क्षतिग्रस्त हो जाएगा हुक.
- नीचे को वापस कक्ष और मुख ganglia के बीच आर.एन. शाखाओं पिन. फिर I2 मांसपेशी RNs के शीर्ष पर होगा. I2 तंत्रिका का पर्दाफाश, संदंश उपयोग I2 मांसपेशी हड़पने और यह मुख ganglia पर खींच. I2 तंत्रिका को नुकसान से बचने के लिए पिन I2 की मांसपेशी के दो कोनों.
- Sever I2 तंत्रिका जो बिंदु पर अपनी दो शाखाओं I2 मांसपेशी में विलय को बाहर. यकीन है कि अभी भी मांसपेशी vivo रिकॉर्डिंग में बराबर होना innervated है. दूर I2 की मांसपेशी के बाकी काटो और I2 तंत्रिका वापस फ्लिप और यह पिन नीचे दो आर.एन. शाखाओं के बीच (2 चित्रा, इनसेट देखें).
- पिन खिंचाव और तनाव जोड़ने के स्थानों समायोजित अगर एक तंत्रिका भी ढीला है, या एक nerv अगर तनाव जारीई भी तंग है. आगे मुख ganglia को स्थिर करने के लिए, नसों के बीच म्यान पर और पिन जोड़ने.
- चूंकि मुख ganglia दुम का पक्ष रखा है, मुख ganglia बारी बारी से अगर ब्याज की न्यूरॉन्स व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष पर हैं. एक दो मुख ganglia के बारी बारी से, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए सीबीसी के कुछ अतिरिक्त म्यान हड़पने जहां यह मुख ganglia के पास है और यह नीचे पिन BN2 और BN3 के बीच. कुछ ganglia में, इसे और अधिक सुविधाजनक हो सकता है यह सीबीसी और BN3 के बीच नीचे पिन.
- सामने कक्ष के करीब की ओर मुख नाड़ीग्रन्थि के आंदोलन को कम करने पर मुख नाड़ीग्रन्थि की म्यान पर एक अतिरिक्त पिन जोड़ें.
- मुख ganglia को कवर म्यान ट्रिम, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए पक्ष वापस कक्ष के करीब पर म्यान हड़पने, और फिर दूर सेल निकायों को प्रकाश में लाने के बिना ठीक कैंची के साथ अतिरिक्त म्यान में कटौती. आदेश में क्षति को कम से कम करने के लिए, केवल सेल शरीर को देखने के लिए आवश्यक म्यान की न्यूनतम राशि को हटा दें.
- टी के बादवह मुख ganglia के म्यान छंटनी की है, I2 तंत्रिका और RNs मुख ganglia पर खींचने के लिए और उन्हें मुख ganglia और सामने कक्ष के आगे मुख ganglia बारी बारी के बीच नीचे पिन. (2 चित्र देखें).
- बाहर किसी भी शेष का मैग्नीशियम 8 क्लोराइड है कि विच्छेदन पहले पशु anesthetize इस्तेमाल किया गया था धोने, पकवान में ताजा Aplysia खारा साथ Aplysia खारा की जगह.
5. विद्युत हुक इलेक्ट्रोड कनेक्ट
- बाद ganglia और मांसपेशियों के लिए तैयार हैं, तो ध्यान से प्रयोगों के लिए कंपन अलगाव तालिका पकवान हस्तांतरण.
- इलेक्ट्रोड पिंस संलग्न BNC केबलों कि (ए. सिस्टम मॉडल 1700 एम्पलीफायर) एम्पलीफायरों से कनेक्ट पर उनकी कुर्सियां. फिर, यकीन है कि इलेक्ट्रोड कसकर नहीं खींच लिया, जबकि यह कर रहे हैं. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड सही ढंग से उनके उपयुक्त केबल जुड़े होते हैं और छोर सही है कि. 6. सोमा रिकॉर्डिंग के लिए बाह्य ग्लास इलेक्ट्रोड की स्थापना
- Aplysia नमक के साथ इलेक्ट्रोड एक लगभग 15-20 सेमी की polyethylene टयूबिंग की एक टुकड़ा जुड़ी सिरिंज का उपयोग कर भरें. ग्लास इलेक्ट्रोड के अंत polyethylene टयूबिंग मुक्त अंत संलग्न. सिरिंज के सवार खारा Aplysia साथ इलेक्ट्रोड भरने पर वापस खींचो.
- भरे मैनिप्युलेटर पर धारक के पायदान में कोशिकी ग्लास इलेक्ट्रोड रखें. मैनिप्युलेटर प्रयोग मुख ganglia युक्त Aplysia खारा में इलेक्ट्रोड टिप जगह.
- एक / चांदी चांदी क्लोराइड इलेक्ट्रोड में एक पुरुष सोने संबंधक पिन रिकॉर्डिंग तार के रूप में सेवा करने के लिए soldered तार डालें. एक और क्लोराइड / चांदी चांदी के तार सीधे रिकॉर्डिंग मुख संदर्भ तार के रूप में कार्य ganglia युक्त पकवान के अनुभाग भीतर Aplysia नमक में एक पुरुष सोने की पिन संबंधक soldered रखें. दोनों वें कनेक्टई रिकॉर्डिंग और bnc केबल कि एम्पलीफायर को जोड़ता संदर्भ तारों.
- अगर वहाँ अधिक manipulators के लिए पर्याप्त कमरे है, अतिरिक्त बाह्य कांच इलेक्ट्रोड कई न्यूरॉन्स के साथ जोड़ा जा सकता है.
- तंत्रिका के व्यास मैच टिप चूषण इलेक्ट्रोड की संकीर्ण अंत छाँटो. इलेक्ट्रोड टिप के भीतरी व्यास के लिए इसी तरह की या तंत्रिका व्यास की तुलना में थोड़ा छोटा तंग चूषण सुनिश्चित होना चाहिए.
- चूंकि I2 तंत्रिका और आर.एन. एक दूसरे के बहुत करीब हैं, उनके इलेक्ट्रोड ही मैनिप्युलेटर द्वारा आयोजित किया जा सकता है अंतरिक्ष को बचाने के. उसी धारक के दो डिग्री में दो इलेक्ट्रोड रखें. दो इलेक्ट्रोड घुमाएँ और सुनिश्चित करें कि उनके सुझावों को एक दूसरे के करीब हैं. I2 तंत्रिका रिकॉर्डिंग के लिए उनमें से एक, आर.एन. रिकॉर्डिंग के लिए अन्य एक चुनें.
- Recordin भीतर Aplysia खारा में इलेक्ट्रोड टिप जगहछ मुख ganglia युक्त पकवान. चूषण इलेक्ट्रोड के लिए सिरिंज पर पॉलीथीन टयूबिंग मुक्त अंत संलग्न. सिरिंज का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रोड के साथ Aplysia खारा को भरने के लिए. इलेक्ट्रोड लक्ष्य तंत्रिका के अंत तक करीब टिप चाल, I2 तंत्रिका यानी, और सिरिंज का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रोड में तंत्रिका चूसना. इलेक्ट्रोड भीतर तंत्रिका 0.5-1.0 मिमी की लंबाई के बारे में एक तंग सील यह सुनिश्चित करना चाहिए.
- दोहराएँ इलेक्ट्रोड के लिए चूषण कि आर.एन. से जुड़ी होगी.
- इसी BNC केबल के रूप में 6.3 खंड में वर्णित इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
- पेशी के लिए बल transducers संलग्न, रेशम sutures का उपयोग करें. प्रत्येक सीवन के घुमावदार सुई बेंड, और बल transducer सीवन टाई. धीरे संदंश के साथ मांसपेशियों की एक छोटी राशि हड़पने के लिए और उठा और संदंश के दूसरे सेट में सुई धारण, सम्मिलितमांसपेशियों के माध्यम से सुई सुई में तुला बिंदु (1 चित्रा).
- Transducers I1/I3 पेशी पर या तो पीछे की ओर या laterally संलग्न कर सकते हैं. पृष्ठीय लगाव या तो मांसपेशी के बाईं या दाईं ओर की सक्रियता से पैदा संकुचन की माप की अनुमति देता है. न्यूरॉन्स के बहुमत के लिए मजबूत बलों पार्श्व लगाव दिखाने के लिए, लेकिन केवल पक्ष जो transducer जुड़ा हुआ है पर संकुचन की माप की अनुमति देगा.
- न्यूरॉन्स कि I1/I3 के पूर्वकाल, पीछे, या दोनों क्षेत्रों को सक्रिय कर सकते हैं की पहचान में मदद करने के लिए, मांसपेशियों के पीछे भाग के लिए एक बल transducer देते हैं, सिर्फ pharyngeal ऊतकों को पूर्वकाल और के पूर्वकाल हिस्सा करने के लिए एक और बल transducer देते हैं मांसपेशी, जबड़े (1 चित्र, नोट हुक) पर.
- बल transducers लिफ्ट जब तक sutures तना हुआ खींच रहे हैं, लेकिन overstretch नहीं है. इस जांच, बल transducer से माप को देखने जब सीवन में मैं कुछ सुस्त हैटी, और फिर transducer उठा जब तक माप इस आधारभूत स्तर से थोड़ा ऊपर है.
- एक मोटर पूल के भीतर extracellularly मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए इस प्रोटोकॉल एक प्रक्रिया का वर्णन करता है. हम AxoGraph सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल व्यक्तिगत न्यूरॉन्स, कई नसों और मांसपेशियों (EMG संकेत या संकुचन बलों) की गतिविधि पर नजर रखने के लिए. इस प्रोटोकॉल में, हम मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने की प्रक्रिया के लिए एक उदाहरण के रूप में मांसपेशियों के संकुचन बलों का इस्तेमाल किया, अन्य प्रयोगों में, हम EMG के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया है, और इस तरह के प्रयोगों के लिए सेटअप बहुत समान है (चर्चा देखने के लिए).
- एक उम्मीदवार न्यूरॉन का पता लगाने के लिए, मैनिप्युलेटर का उपयोग करने के लिए धीरे कोशिकी कांच इलेक्ट्रोड की टिप न्यूरॉन सोमा 5 (3 चित्रा), है जो उत्तेजना और रिकॉर्डिंग चयनात्मकता 5 के लिए सबसे अच्छा स्थान है की केंद्र पर म्यान पर नीचे प्रेस. चूंकि सीमा वर्तमान चया एक न्यूरॉन को सक्रिय इलेक्ट्रोड सोम 5 दूरी के साथ linearly बढ़ जाती है, उत्तेजना चयनात्मकता बदतर हो जाएगा जब इलेक्ट्रोड एक पड़ोसी न्यूरॉन की ओर लक्ष्य न्यूरॉन के केंद्र से दूर ले जाया जाता है.
- एक मोटर न्यूरॉन की पहचान करने के लिए, 1 सीधे कोशिकी ग्लास इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि केवल इस न्यूरॉन फायरिंग है न्यूरॉन को प्रोत्साहित करने के लिए, और जांच करने के लिए कि क्या यह मांसपेशियों innervates. फिर, extracellularly इस न्यूरॉन से रिकॉर्ड स्थापित करने के लिए एक एक के लिए एक कोशिकी सोमा रिकॉर्डिंग और तंत्रिका रिकॉर्डिंग, जो भी है न्यूरॉन पहचान के लिए महत्वपूर्ण है के बीच संबंध.
- के बाद से सबसे कोशिकी एम्पलीफायरों एक साथ और एक चैनल में उत्तेजना रिकॉर्डिंग की अनुमति नहीं है, करने के लिए प्रोत्साहित करना और उत्तेजना मोड सोमा (सोम चैनल) और रिकार्ड एक संक्षिप्त वर्तमान anodic (जैसे 6 Aplysia न्यूरॉन्स के लिए 5 मिसे) लागू किया चैनल सेट मैं नोट तीर 1, सोम (4A आंकड़े, 5An दोनों) के आंकड़े, एक कम वर्तमान (जैसे μA 200) से शुरू, और धीरे - धीरे न्यूरॉन फटने जब तक कि वर्तमान बढ़ती.
- एक बार न्यूरॉन फट करने के लिए सक्रिय है, एक तत्काल सोमा उत्तेजना मोड से रिकॉर्डिंग मोड (दोनों आंकड़ों में नोट तीर 2 4A आंकड़े, 5A) चैनल स्विच करना चाहिए. हालांकि, अब भी सोमा और मानव प्रतिक्रिया में देरी की वजह से उत्तेजना रिकॉर्डिंग के बीच देरी हो जाएगा.
- यदि समय की उचित राशि के लिए न्यूरॉन आग, यह संभव हो सकता का पालन करना चाहिए एक सोमा रिकॉर्डिंग से और तंत्रिका (ओं) पर एक के लिए इसी कार्रवाई की क्षमता के माध्यम से जो न्यूरॉन परियोजनाओं (4B आंकड़े, 5 ब, नोट धराशायी लाइनों ), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन (4A आंकड़े, 5A द्वारा उत्पन्न बलों, ध्यान दें नीले बक्से). यदि न्यूरॉन फायरिंग सोम रिकॉर्डिंग शुरू होने से पहले बंद हो जाता है, यह एक लंबे समय के लिए सक्रिय करने के लिए वर्तमान में वृद्धि हुई है.
- कोशिकी का संकेत करने के लिए शोर अनुपातरिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड स्थान और सोमा के आकार पर निर्भर करता है. कोशिकी रिकॉर्डिंग सोम आकार में वृद्धि और इलेक्ट्रोड सोमा दूरी घट जाती है के रूप में बड़ा हो जाएगा. चूंकि शोर ही एक सीमित दायरे में बदलता है, संकेत करने वाली शोर अनुपात सोम का आकार बढ़ता है और इलेक्ट्रोड सोमा दूरी घट जाती है के रूप में भी वृद्धि होगी. संकेत करने वाली शोर अनुपात की सबसे आम रेंज 04:01 से 08:01 तक है.
- मोटर न्यूरॉन्स सोम स्थान, तंत्रिका के प्रक्षेपण और मांसपेशी 4,6,7 innervation के रूप में उनकी विशेषताओं, के आधार पर पहचाना जा सकता है. के बाद से ही दो BN2s मुख जन से जुड़े होते हैं BN2s पर गतिविधि की निगरानी, एक यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि मांसपेशी संकुचन बल केवल बाह्य उत्तेजना से सक्रिय न्यूरॉन के कारण होता है.
- उदाहरण के लिए, B3 I1/I3 पेशी के लिए एक बड़ी मोटर न्यूरॉन (200 से 350 ग्राम वजन के पशुओं में सोमा व्यास में 300-400 सुक्ष्ममापी), मुख नाड़ीग्रन्थि का व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष पर स्थित (3 चित्रा
- एक न्यूरॉन के बाद पहचान की है, अपनी गतिविधि कोशिकी ग्लास (4 आंकड़े और 5) इलेक्ट्रोड, जो हासिल हो नीचे के रूप में वर्णित किया जा के माध्यम से विभिन्न तरह खिला - व्यवहार में दर्ज किया जा सकता है. सोमा पर कोशिकी रिकॉर्डिंग अधिक तंत्रिका रिकॉर्डिंग है जो कई अलग न्यूरॉन्स की गतिविधियों में शामिल हैं की तुलना में विशिष्ट होगा.
- करने के लिए egestive तरह मोटर कार्यक्रमों प्रेरित, 1-2 मिनट (2Hz, प्रत्येक नाड़ी मिसे 1) 19 दालों के साथ BN2 एक को प्रोत्साहित. इस उत्तेजना को मज़बूती से इस सेटिंग में egestive पैटर्न उत्पन्न करता है. पर्याप्त वर्तमान (उदाहरण के μA 300), पैटर्न उत्तेजना की अवधि के लिए रह सकता है. कभी कभी वहाँ एक अधिक पैटर्न है कि बाद शीघ्र ही होता होगाउत्तेजना समाप्त होता है.
- डालने वाला जैसे मोटर कार्यक्रम को प्रेरित करने के लिए, मस्तिष्क 15 नाड़ीग्रन्थि की म्यान पर सीधे ठोस carbachol की कुछ क्रिस्टल की जगह है. यदि एक carbachol जोखिम के स्तर को नियंत्रित करना चाहता है, 1 से 10 मिमी Aplysia खारा में carbachol के एक समाधान का उपयोग करें. उच्च सांद्रता अधिक प्रतिक्रियाओं प्रेरित होने की संभावना हैं. दोहराए पैटर्न आम तौर पर पांच मिनट के भीतर शुरू हो, और नीचे से चलाने के शुरू होने से पहले लगभग दस से पंद्रह मिनट के लिए पिछले कर सकते हैं.
- बाहर carbachol कई बार धोने और कम से कम 30 मिनट के लिए इंतजार कर के बाद, carbachol के बाद में एक आवेदन मस्तिष्क अधिक डालने वाला की तरह मोटर पैटर्न प्रेरित नाड़ीग्रन्थि में जोड़ा जा सकता है.
- के बाद विशेष रूप से मोटर पूल के लिए कई मोटर न्यूरॉन्स की पहचान की गई है और मोटर के कार्यक्रमों के दौरान होती है, एक एक बहुत सरल निदान पद्धति का विकास हो सकता है कि जल्दी से भविष्य के काम में इन न्यूरॉन्स (चित्रा 6 की पहचान करने के लिए कम से कम जानकारी की आवश्यकता </ Strong>), उदाहरण के लिए निलंबित मुख बड़े पैमाने पर तैयारी में या vivo में. मापदंड सोमा आकार और स्थान, तंत्रिका प्रक्षेपण, नसों पर इकाई आकार, और गतिविधियों की मोटर पैटर्न के दौरान समय शामिल हो सकते हैं.
7. तंत्रिका रिकॉर्डिंग के लिए सक्शन इलेक्ट्रोड स्थापना
8. सेना ट्रांन्सड्यूसर I1/I3 मांसपेशी संकुचन उपाय
9. एक मोटर पूल के भीतर मोटर न्यूरॉन्स की पहचान
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Representative Results
आंकड़े 4 और 5 ठेठ दो I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता परिणाम बताते हैं 4 चित्रा egestive तरह और डालने वाला तरह पैटर्न (आंकड़े 4C, 4D) के दौरान एक बड़े मोटर न्यूरॉन, बी 3, सोम रिकॉर्डिंग से पता चलता है. एक एक के लिए सोमा चैनल और ipsilateral BN2 चैनल (चित्रा 4E) शो कि B3 सोम रिकॉर्डिंग की विशिष्टता पैटर्न के दौरान बनाए रखा गया था पर इसी spikes. B3 पैटर्न के मध्य से देर त्याग चरण के दौरान आग. चित्रा 4 और अन्य परिणाम (नहीं दिखाया गया है) से, हमने पाया है कि B3 की BN2 इकाई हमेशा सबसे बड़ा BN2 इकाई है. इस प्रकार, यह भी BN2 रिकॉर्डिंग से सीधे कर सकते हैं पता लगाया जा.
चित्रा 5 egestive तरह और डालने वाला तरह पैटर्न (आंकड़े 5C, 5D) के दौरान एक छोटे न्यूरॉन, B43, सोमा रिकॉर्डिंग से पता चलता है. एक एक लिए सोमा चैनल पर इसी spikesऔर ipsilateral BN2 चैनल (चित्रा 5E) यह भी पता चलता है कि B43 सोम रिकॉर्डिंग की विशिष्टता पैटर्न के दौरान बनाए रखा गया था. न्यूरॉन B43 फटने पैटर्न दौरान त्याग चरण के अंत में. B43 के BN2 इकाई के बाद से छोटा है, तो यह मुश्किल हो सकता है यह सोम रिकॉर्डिंग के बिना BN2 रिकॉर्डिंग से पहचान होगा, तथापि, क्योंकि यह BN2 मोटर पैटर्न के अंत में सबसे अधिक तीव्रता से आग, B43 फट के अंत अभी भी पहचान की जा सकता है से अकेले BN2 रिकॉर्डिंग.
चित्रा 6 है कि एक कसौटी है, जो यह बहुत आसान extracellularly I1/I3 निलंबित मुख बड़े पैमाने पर तैयारी में या vivo में मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए बनाता है के रूप में मांसपेशी innervation की आवश्यकता नहीं है एक अनुकूलित नैदानिक पेड़ से पता चलता है. नैदानिक विकसित पेड़, तथापि, बल और EMG के उपायों का उपयोग करके, और इस तरह से दिखाता है कि कैसे इस प्रोटोकॉल में तकनीक सुव्यवस्थित मोटर न्यूरॉन पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
चित्रा 1. समग्र सेटअप और बल के अध्ययन के लिए पकवान के योजनाबद्ध शीर्ष छवि एक शीर्ष देखने से पता चलता है. नीचे छवि (शीर्ष दृश्य के बीच में धराशायी लाइन करने के लिए इसी) एक तरफ देखने से पता चलता है. मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि वापस कक्ष में Sylgard (एक क्षेत्र) पर टिकी है. मुख ganglia Sylgard मध्यम मंच क्षेत्र (सी) पर टिकी हैं. वापस चैम्बर और मध्यम मंच एक ऊंचा Sylgard दीवार क्षेत्र (बी) से अलग हो रहे हैं. मस्तिष्क मुख connectives (CBCs) Sylgard दीवार में एक पायदान के माध्यम से गुजरती हैं, वैक्यूम तेल के साथ बंद. मुख जन सामने चैम्बर के कांच के नीचे क्षेत्र (डी) के लिए सरेस से जोड़ा हुआ है. मुख 2 तंत्रिकाओं (BN2s) मुख जन से जुड़े होते हैं. दो रेशम sutures से जुड़ी हुक I1/I3 मांसपेशी की पूर्वकाल और कूल्हों क्षेत्रों में डाला जाता है. टीवह रेशम sutures तो बल transducer बंधे हैं. आंकड़ा अंधेरे ग्रे, हल्के भूरे रंग के, और सफेद करने के लिए ए, बी, सी और डी गहरे रंग, उच्च इसी सतह क्षेत्रों की सतहों का संकेत का उपयोग करता है. आंकड़ा एक, ख, ग, और घ का उपयोग करता है पकवान की महत्वपूर्ण आयामों का संकेत है. लंबाई एक 3-4 मिमी, पायदान कि वापस कक्ष और मध्य मंच जोड़ता की चौड़ाई है. लंबाई ख 3-5 मिमी, मध्य क्षेत्र (सी) मंच और Sylgard दीवार क्षेत्र (बी) की सतहों के बीच ऊंचाई में अंतर के बारे में है. लंबाई ग पायदान की लंबाई, जो के बारे में 5 मिमी है इंगित करता है. लंबाई घ मध्य क्षेत्र (सी) मंच है, जो के बारे में 5 मिमी की चौड़ाई से पता चलता है.
चित्रा 2. मुख ganglia के योजनाबद्धऔर सेटअप इलेक्ट्रोड. आंकड़ा मुख नसों 1, 2, और 3 (BN1, BN2, और BN3), esophageal (एन) तंत्रिका, radular तंत्रिका (आर एन), I2 तंत्रिका और मांसपेशियों नसों, सहित प्रमुख स्थानों से पता चलता है , और मस्तिष्क मुख संयोजी (सीबीसी). ध्यान दें कि BN2s मुख जन से जुड़े होते हैं (चित्रा 1 देखें). CBCs मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि जुड़े होते हैं, Sylgard दीवार के निशान से गुजर रहे हैं और वैक्यूम तेल के साथ बंद (चित्रा 1 देखें). आर.एन. और I2 तंत्रिका और मांसपेशी ganglia ऊपर खींच रहे हैं और मुख द्रव्यमान (सामने दिशा) समीपस्थ टिकी. ब्लू लाइनों पिन के स्थान का संकेत मिलता है. दो तुला पिन (लाल लाइनों 1 लेबल) CBCs लंगर के लिए किया जाता है. ध्यान दें कि बाईं ओर सीबीसी की म्यान के एक प्रालंब मुड़ा और BN2 और BN3 के बीच नीचे टिकी छोड़ दिया मुख नाड़ीग्रन्थि (लाल रेखा 2 लेबल) को बारी बारी से. कुछ ganglia में, इसे और अधिक करने के लिए सीबीसी और BN3 के बीच म्यान नीचे पिन सुविधाजनक हो सकता है. एक अतिरिक्त पिन टी कहा जाता हैनाड़ीग्रन्थि की ओर है कि एन आगे रोटेशन और स्थिरीकरण के लिए (लाल रेखा 3 लेबल) समीपस्थ है ओ. कोशिकी कांच इलेक्ट्रोड कोशिकी उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए सोमा ऊपर म्यान के शीर्ष पर रखा गया है. हुक इलेक्ट्रोड BN3s से जुड़े होते हैं और जगह में उन नसों पकड़े पिंस इन हुक इलेक्ट्रोड के लगाव अंक की तुलना में अधिक distally रखा जाना चाहिए. दो चूषण इलेक्ट्रोड आर.एन. और I2 तंत्रिका और मांसपेशी (I2 तंत्रिका और मांसपेशी के एक स्पष्ट देखने के लिए इनसेट देखते) में संलग्न हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. एक तस्वीर और I1/I3 मोटर की कोशिकी पहचान के लिए न्यूरॉन नक्शे के योजनाबद्धAplysia मुख नाड़ीग्रन्थि में न्यूरॉन्स शीर्ष चित्र दाईं ओर मुख नाड़ीग्रन्थि से पता चलता है., दुम का पक्ष टिकी. मुख ganglia, आर.एन. और I2 तंत्रिका / मांसपेशी घुमाने मुख ganglia ऊपर खींच रहे हैं और एन की ओर करने के लिए समीपस्थ टिकी. सीबीसी म्यान के एक प्रालंब भी जोड़ रहा है और रोटेशन के लिए टिकी (चित्रा 2 देखें), इतना है कि व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष में या लांगुलिय / व्याख्यान चबूतरे वाला सीमा में न्यूरॉन्स देखा जा सकता है. नीचे योजनाबद्ध ऊपर चित्र के आधार पर तैयार की है. चित्र और योजनाबद्ध के साथ I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स B3, बी -6, B9, B10, B38, B39, 22,23 6,7 B43 और B82, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ अन्य न्यूरॉन्स के स्थानों से संकेत मिलता है. न्यूरॉन्स B8a और B8b आर.एन. पर सबसे बड़ी इकाई के लिए जिम्मेदार हैं, और मांसपेशियों 6,17 grasper को नियंत्रित I4 अंदर आना. B4 और B5 न्यूरॉन्स BN3 18 पर सबसे बड़ी इकाई के लिए जिम्मेदार हैं. हालांकि I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स के आकार और स्थानों जानवर टी से चर रहे हैंओ पशु, सापेक्षिक आकार और स्थानों के अधिकांश न्यूरॉन्स के लिए काफी विश्वसनीय हैं: B3, बी -6, B9, B38, B43, और B82. I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स, विशेष रूप से कुछ विशिष्ट B10 और B39 की पहचान की कठिनाइयों के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें.
चित्रा 4. पहचान करना और निस्र्पक I1/I3 मोटर न्यूरॉन B3. ए) B3 के बाह्य उत्तेजना (तीर पर 1) और B3 सोम (2 तीर पर शुरू) से रिकॉर्डिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इसी नसों और मांसपेशियों क्षेत्रों से. ऊपर से नीचे तक, चैनल B3 सोमा, contralateral BN2, ipsilateral BN2 ipsilateral BN3, I1/I3 मांसपेशी के पूर्वकाल क्षेत्र के संकुचन बल, और संकुचन के पीछे क्षेत्र के बल से रिकॉर्डिंग कर रहे हैं I1/I3 मांसपेशियों.नीले बॉक्स I1/I3 मांसपेशी की पूर्वकाल और कूल्हों क्षेत्रों में सेना की अवधि पर प्रकाश डाला गया. इस विशेष मामले में, पीछे बल पूर्वकाल बल की तुलना में अधिक बी) A1 में लाल बॉक्स द्वारा उल्लिखित क्षेत्र के विस्तृत दृश्य है. एक के लिए एक से B3 सोम और iBN2 चैनलों में इसी कार्रवाई की क्षमता है कि ipsilateral BN2 पर B3 केवल परियोजनाओं सी) B3 सोम से कोशिकी रिकॉर्डिंग और एक मोटर egestive तरह पैटर्न में नसों. डी) कोशिकी रिकॉर्डिंग दिखाने B3 सोमा और एक मोटर डालने वाला तरह पैटर्न में नसों. सी और डी में ऊपर से नीचे तक, चैनल B3 सोम, I2 तंत्रिका, आर.एन., ipsilateral BN2 और BN3 ipsilateral से रिकॉर्डिंग कर रहे हैं. नीले बक्से और पैटर्न के अतिकाल त्याग चरणों का संकेत मिलता है. दोनों सी और डी में B3 सोम चैनल में लाल सलाखों कार्रवाई पॉट पर प्रकाश डालाentials B3 सोम से दर्ज की गई. दोनों सी और डी में iBN2 चैनल में लाल सलाखों के इसी समय से संकेत मिलता है जब B3 ipsilateral BN2 में मोटर पैटर्न खिला के दौरान फायरिंग है ई.) B3 सोम की विस्तृत दृश्य और iBN2 लाल सलाखों द्वारा चिह्नित चैनलों. धराशायी लाइनों के एक एक लिए B3 सोमा में कार्रवाई क्षमता और iBN2 चैनलों के बीच संबंध दिखाने के लिए. नोट: है कि B3 की BN2 इकाई सभी इकाइयों का सबसे बड़ा है. इस प्रकार, हम भी B3 के BN2 इकाइयों को सीधे पता लगा सकते हैं सोमा रिकॉर्डिंग के बिना BN2 रिकॉर्डिंग से. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. पहचान करना औरI1/I3 मोटर न्यूरॉन, B43 B43 के एक) कोशिकी उत्तेजना (तीर पर 1) और अपने सोमा से रिकॉर्डिंग (2 तीर पर शुरू) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इसी नसों और मांसपेशियों क्षेत्रों से निस्र्पक. ऊपर से नीचे तक, चैनल B43 सोम, contralateral BN2, ipsilateral BN2 ipsilateral BN3, I1/I3 मांसपेशी के पूर्वकाल क्षेत्र के संकुचन बल, और संकुचन के पीछे क्षेत्र के बल से रिकॉर्डिंग कर रहे हैं I1/I3 मांसपेशियों. नीले बॉक्स B43 गतिविधि के दौरान I1/I3 मांसपेशी के बल माप पर प्रकाश डाला गया है. B43 सक्रिय एक छोटे से पीछे बल उत्पन्न करता है, लेकिन कोई पूर्वकाल बल. बी) क्षेत्र की विस्तृत दृश्य एक में लाल बॉक्स द्वारा उल्लिखित. धराशायी लाइनों से पता चलता है एक एक लिए B43 सोमा में कार्रवाई क्षमता और iBN2 चैनलों, जो कि ipsilateral BN2 केवल सी B43 परियोजनाओं) कोशिकी रिकॉर्डिंग का संकेत के बीच के रिश्तेB43 और एक मोटर egestive तरह पैटर्न में सोमा नसों से डी) B43 सोमा और एक मोटर डालने वाला तरह पैटर्न में नसों से कोशिकी रिकॉर्डिंग. सी और डी में ऊपर से नीचे तक, चैनल B43 सोम, I2 तंत्रिका, आर.एन., ipsilateral BN2 और BN3 ipsilateral से रिकॉर्डिंग कर रहे हैं. नीले बक्से और पैटर्न के अतिकाल त्याग चरणों का संकेत मिलता है. B43 दोनों सी और डी में सोमा चैनल में लाल सलाखों कार्रवाई B43 सोमा से दर्ज की क्षमता पर प्रकाश डाला. दोनों सी और डी में iBN2 चैनल में लाल सलाखों के इसी समय से संकेत मिलता है जब B43 इन नमूनों में ipsilateral BN2 में फायरिंग है ई.) B43 सोम की विस्तृत दृश्य और iBN2 डी में लाल पट्टी द्वारा चिह्नित चैनल. धराशायी लाइनों B43 सोमा में कार्रवाई की क्षमता के बीच संबंध दिखाने के लिए एक के लिए एक ई में नीचे पैनल में दिखाया इकाई एक B43 एक और कोशिकी यूनिट के साथ सोमा इकाई की टक्कर है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
6 चित्रा. I1/I3 कोशिकी सोमा और तंत्रिका रिकॉर्डिंग का उपयोग मोटर न्यूरॉन्स के कुछ की पहचान करने के लिए अनुकूलित नैदानिक पेड़ इस नैदानिक विधि I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए कम से कम जानकारी की आवश्यकता है, की पहचान करने के लिए यह बहुत आसान बनाfy निलंबित मुख बड़े पैमाने पर तैयारी में या vivo में मोटर न्यूरॉन्स. B3 की पहचान I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स के बीच सबसे बड़ा BN2 इकाई है. मोटर न्यूरॉन्स, बी -6 और B9 के बाकी में केवल दो न्यूरॉन्स कि दोनों BN2 और BN3 परियोजना. B9 बी -6 की तुलना में अधिक पार्श्व है. BN2 पर ही पेश न्यूरॉन्स के बाकी के दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है. BN2s के माध्यम से द्विपक्षीय स्तर पर एक न्यूरॉन्स परियोजनाओं के समूह है, जो B10 और B39 और कुछ अज्ञात न्यूरॉन्स शामिल हैं. न्यूरॉन्स के अन्य समूह केवल BN2 पर ipsilaterally परियोजनाओं, जो B38, B43, B82 और शामिल है. B38 B3 और B9 के पास है. B82 B8 (चित्र देखें 3) के पास है. B43 बी -6 के पास है. इसके BN2 इकाई खिला पैटर्न के अंत में छोटे और फटने है.
चित्रा 7. न्यूरॉन मैं की सफलता दर की तुलनाबल या तो कोशिकी तकनीक या intracellular तकनीक का उपयोग करते हुए प्रयोगों के दौरान dentification एक ही बल transducer सेटअप के साथ, हम 35 प्रयोगों कोशिकी (छोटे नीले डॉट्स) तकनीक और 27 प्रयोगों का उपयोग पारंपरिक intracellular (बड़े बैंगनी डॉट्स) तकनीक का उपयोग करने के लिए की पहचान I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स. x-अक्ष I1/I3 मांसपेशी है कि प्रयोग के प्रत्येक प्रकार में पहचान की गई के लिए मोटर न्यूरॉन्स की कम से कम संख्या को इंगित करता है. y-अक्ष प्रयोग के प्रत्येक प्रकार के प्रतिशत सफलता दर को इंगित करता है. उदाहरण के लिए, 35 के बाहर कोशिकी प्रयोगों के 19 (54%) में, हम कम से कम पांच अलग I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम थे. 1 प्रयोगों के intracellular (4%) 27 से बाहर ही में, हम करने के लिए कम से कम पांच I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम थे. यह स्पष्ट है कि न्यूरॉन्स की पहचान करने में सफलता दर कोशिकी तकनीक का उपयोग कर न्यूरॉन्स की किसी भी संख्या के लिए बहुत अधिक है.
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Discussion
(उदाहरण के लिए, Lymnaea,, कुण्डल, और Aplysia) घोंघे, मोटर पूल के विश्लेषण के रूप में बड़ी पहचान की न्यूरॉन्स के साथ पशुओं में आम तौर पर intracellular 1,2,3,4 रिकॉर्डिंग का उपयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल में, हम विशिष्ट कोशिकी एक तकनीक का उपयोग करते हुए एक मोटर पूल के लिए मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन है. हम इस प्रक्रिया का एक उदाहरण के बल माप के रूप में इस्तेमाल किया. एक भी EMG का उपयोग करने के लिए मांसपेशी innervations उपाय कर सकता है. संक्षेप में, ऐसा करने के लिए प्रोटोकॉल के लिए EMG रिकॉर्डिंग के लिए I1/I3 मांसपेशी के विभिन्न क्षेत्रों के लिए हुक इलेक्ट्रोड संलग्न करने के लिए परिवर्तित किया जा जरूरत है.
कोशिकी तकनीक intracellular तकनीक, जिनमें से कुछ पहले से ही ऊपर वर्णित किया गया है पर कुछ फायदे हैं. सबसे पहले, कोशिकी तकनीक कम समय और प्रयोगों के लिए ganglia तैयार है और कम न्यूरॉन्स के लिए नुकसान का कारण होगा प्रयास की आवश्यकता है. आमतौर पर, यह 20-30 मिनट लेने के लिए buc तैयार करेंगेकोशिकी प्रयोगों के लिए कैलोरी ganglia और 1.5 लगभग घंटा मुख ganglia कि intracellular प्रयोगों के लिए मुख द्रव्यमान से जुड़े होते हैं तैयार. चूंकि मांसपेशियों को कम सक्रिय हो जाते हैं के रूप में समय गुजरता है, कोशिकी प्रयोगों के लिए ganglia तैयारी और intracellular लोगों के बीच समय के अंतर को प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हो चित्रा 7 / I1 के लिए मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए सफलता दर की तुलना से पता चलता है हो सकता है I3 मांसपेशी बल अध्ययन में कोशिकी या intracellular तकनीक का उपयोग कर. सभी 35 बाह्य बल प्रयोग में (100%), हम I1/I3 मांसपेशियों के लिए कम से कम एक मोटर न्यूरॉन की पहचान करने में सक्षम थे. 35 (89%) कोशिकी प्रयोगों के बाहर 31 में, हम करने के लिए कम से कम तीन I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम थे. 19 में से 35 (54%) की कोशिकी प्रयोगों, हम कम से कम पांच अलग I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम थे. इसके विपरीत, intracellular प्रयोगों की सफलता दर सैम के साथई बल transducer सेटअप में कम थे. 27 (85%) intracellular प्रयोगों के बाहर 23 में, हम कम से कम एक I1/I3 मोटर न्यूरॉन की पहचान करने में सक्षम थे. 27 (30%) intracellular प्रयोगों के बाहर 8 में, हम करने के लिए कम से कम तीन I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम थे. 1 27 (4%) के बाहर ही intracellular प्रयोगों में, हम पाँच I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम थे. इस प्रकार, एक ही नाड़ीग्रन्थि में कई न्यूरॉन्स की पहचान करने की संभावना उच्च intracellular तकनीक के विपरीत में कोशिकी तकनीक का इस्तेमाल करते हैं.
इसके अलावा, कोशिकी तकनीक ही प्रयोग के दौरान ganglia के दोनों पक्षों पर कई न्यूरॉन्स का उपयोग कर सकते हैं. आमतौर पर, desheathing के बाद, intracellular इलेक्ट्रोड केवल नाड़ीग्रन्थि कि desheathed किया गया है के पक्ष में न्यूरॉन्स का उपयोग कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, जब एक दो मुख ganglia (बाईं ओर hemiganglion उदाहरण के लिए) की दुम का पक्ष टिकी है, यह आसान हो सकता है के लिए intracellular इलेक्ट्रोड पर न्यूरॉन्स का उपयोग करने के लिएनाड़ीग्रन्थि, बी -6 जैसे, B9, B10, B39, और B43, लेकिन नाड़ीग्रन्थि के व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष पर B4, B5, B8a, B8b, B38 और B82 के रूप में न्यूरॉन्स का उपयोग करने के लिए मुश्किल की ओर. इसके विपरीत, कोशिकी इलेक्ट्रोड नाड़ीग्रन्थि की उचित रोटेशन के साथ एक ही मुख नाड़ीग्रन्थि के दोनों पक्षों पर कई न्यूरॉन्स का उपयोग कर सकते हैं. रोटेशन की डिग्री समायोज्य और पलटवाँ है. यह भी एक ही नाड़ीग्रन्थि में कई न्यूरॉन्स की पहचान करने की संभावना बढ़ जाती है.
चूंकि कोशिकी इलेक्ट्रोड धीरे न्यूरॉन्स को कवर म्यान पर दबाया जाता है, इन इलेक्ट्रोड न्यूरॉन्स के बाहर नहीं निकाला जा जाएगा, है जो झिल्ली में बड़े छेद बनाने और क्षति हो सकती है, के रूप में मांसपेशी आंदोलनों के दौरान intracellular इलेक्ट्रोड के साथ होता है. संकेत आकार मांसपेशी आंदोलनों के दौरान ganglia कदम के रूप में अलग अलग होंगे. नोट कि बड़ी मांसपेशी आंदोलनों के दौरान कभी कभी, कोशिकी सोमा रिकॉर्डिंग संकेतों या कम हो जाएगा भी खो दिया है. हालांकि, हम आसानी से कर सकते हैं मोन्यूरॉन पर कोशिकी इलेक्ट्रोड वापस ve और मूल संकेतों को ठीक. इस व्यवहार के अध्ययन के दौरान जो मांसपेशियों के रूप में बड़े संकुचन उत्पन्न तैयारी अलग व्यवहार प्रतिक्रियाओं उत्पन्न के लिए निलंबित मुख जन 8 तैयारी कोशिकी तकनीक को लागू करने के लिए संभव बनाता है. उदाहरण के लिए, 48 निलंबित मुख जन प्रयोगों (98%) के बाहर 47 में, हम I1/I3 मांसपेशियों के लिए कम से कम एक मोटर न्यूरॉन की पहचान करने में सक्षम थे. 48 (48%) निलंबित मुख जन प्रयोगों के बाहर 23 में, हम करने के लिए कम से कम तीन I1/I3 मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने में सक्षम थे. 48 (23%) निलंबित मुख जन प्रयोगों में से 11 में, हम मोटर पैटर्न के दौरान उनमें से कम से कम पांच I1/I3 मांसपेशियों और रिकार्ड के लिए मोटर न्यूरॉन्स के रूप में मुख जन खिला - तरह व्यवहार का प्रदर्शन किया गया था की पहचान करने में सक्षम थे. कोशिकी तकनीक भी अन्य अलग सिर खिलाने की तैयारी है कि टी के रूप में इस तरह के और अधिक जटिल अर्द्ध बरकरार तैयारी, के लिए लागू हैवह जाल, होंठ, जबड़े, मुख जन, मुख ganglia, और मस्तिष्क नाड़ीग्रन्थि 12,24,25,26. संवेदी इनपुट के बाद से इस तरह की तैयारी में खिला व्यवहार eliciting के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, कोशिकी तकनीक अपनी सादगी और कम हानिकारक सुविधाओं की वजह से विशेष रूप से उपयोगी होगा. पिछले अध्ययनों से यह भी पता चलता है कि यह संभव है की पहचान करने और लंबे समय से 18 vivo में B4/B5 रिकॉर्ड. पहले इन प्रयोगों में, जांचकर्ताओं कम मौजूदा (10-20 μA) BN2 एक उत्तेजना का इस्तेमाल करने के लिए चुनिंदा B4/B5 को सक्रिय और रिकॉर्डिंग के लिए B4/B5 म्यान के ऊपर एक छोटी polyethylene ट्यूब चिपके, जो में मुड़ की एक जोड़ी डाला गया स्टेनलेस स्टील के तार. इस प्रकार, यह भी संभव है पहचान और vivo में मोटर न्यूरॉन्स कि ganglia (Chestek और Chiel, अप्रकाशित परिणाम) को कवर म्यान पर चिपके है polyethylene ट्यूब इलेक्ट्रोड का उपयोग कर से रिकॉर्ड.
कोशिकी तकनीक भी कुछ limitat हैआयनों. सबसे पहले, यह मुश्किल के लिए कोशिकी इलेक्ट्रोड उत्तेजित या न्यूरॉन्स कि बहुत छोटे या बहुत नाड़ीग्रन्थि भीतर गहरे हैं रिकॉर्ड होगा. ध्यान दें कि यह अभी भी संभव न्यूरॉन्स कि बाह्य उत्तेजना के माध्यम से सतह पर नहीं कर रहे हैं सक्रिय. हालांकि, हमारे 5 मॉडल से पता चला है कि उत्तेजना विशिष्टता खो जब लक्ष्य न्यूरॉन पड़ोसी न्यूरॉन्स से गहरा हो सकता है. जब न्यूरॉन गहरी है, इलेक्ट्रोड करने वाली सोमा दूरी अधिक से अधिक और उच्च वर्तमान इस न्यूरॉन है, जो काफी उच्च अन्य सतह न्यूरॉन्स के पास सक्रिय हो सकता है को सक्रिय करने की जरूरत हो जाएगा होगा. दूसरा, अगर एक न्यूरॉन extracellularly बहुत ज्यादा वर्तमान के साथ प्रेरित है, यह और क्षतिग्रस्त किया जा सकता है अब जवाब नहीं, बहुत छोटे धाराओं intracellular उत्तेजना में उपयोग किया जाता है, हालांकि बहुत ज्यादा वर्तमान intracellularly भी न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचा सकता है. कभी कभी सोमा रिकॉर्डिंग दोनों लक्ष्य न्यूरॉन और आसन्न न्यूरॉन्स, जो कम intracel की तुलना में विशिष्ट है से कई इकाइयां शामिल होंगेlular रिकॉर्डिंग. इसके अलावा, यह अधिक करने के लिए ठीक से नियंत्रित करने के लिए और एक व्यक्ति कोशिकी intracellular तकनीक के बजाय का उपयोग न्यूरॉन फायरिंग आवृत्ति की निगरानी, क्योंकि कोशिकी इलेक्ट्रोड को प्रोत्साहित नहीं है और एक साथ एक ही न्यूरॉन रिकॉर्ड कर सकते हैं के लिए मुश्किल हो सकता है. इसके अलावा, कोशिकी तकनीक premotor न्यूरॉन्स से synaptic इनपुट रिकॉर्ड करने में सक्षम नहीं होगा. इसके अलावा, यह कठिन हो सकता न्यूरोट्रांसमीटर iontophoretically एक विशिष्ट न्यूरॉन के लिए लागू हो सकता है जब तक नाड़ीग्रन्थि desheathed है, हालांकि हम पता चला है कि यह संभव है 27 म्यान हटाने के बिना एक carbachol का उपयोग कर नाड़ीग्रन्थि को प्रोत्साहित.
बाह्य पहचान तकनीकों की सीमाओं की पहचान मुश्किल मोटर पूल में कुछ न्यूरॉन्स बनाया. बी 3, बी -6, B9, B38, B43, और B82, ओ आधारित है: इस विशिष्ट उदाहरण में, कोशिकी तकनीक मज़बूती I1/I3 पेशी के लिए Aplysia में मोटर न्यूरॉन्स के अधिकांश की पहचानn सोम आकार और स्थान, तंत्रिका प्रक्षेपण, और मांसपेशी innervation. हालांकि, हम करने के लिए मज़बूती से B10 और B39 की पहचान करने में सक्षम नहीं किया गया है. पिछला intracellular 6,7 काम से पता चला है कि B10 और B39 मुख ganglia के दुम का पक्ष पर दो सटे क्षेत्र B4/B5 और बी -6 क्षेत्र के बीच, न्यूरॉन्स हैं. दोनों न्यूरॉन्स BN2s पर द्विपक्षीय स्तर पर परियोजना. B10 I1/I3 मांसपेशी के बीच और पीछे क्षेत्र innervates है, जबकि B39 I1/I3 मांसपेशी के पूर्वकाल क्षेत्र innervates. सोमा स्थान और तंत्रिका प्रक्षेपण मापदंड के आधार पर, हम चार अलग - अलग प्रयोगों में BN2s पर द्विपक्षीय स्तर पर अधिक से अधिक दो मोटर कि परियोजना न्यूरॉन्स पाया. चूंकि अपने सोमा स्थानों, मांसपेशियों में innervations, और गतिविधि है की मोटर पैटर्न के दौरान समय जानवर से पशु चर रहे थे, हमें यकीन है कि अगर वे एक ही न्यूरॉन्स थे नहीं थे. इस प्रकार, हम करने के लिए मज़बूती से पहचान B10 और B39 निरंतरता की कमी की वजह से बाह्य तकनीक का उपयोग करने में सक्षम नहीं थे. विशिष्ट उन्हें पहचान करने,हम मुख ganglia में न्यूरॉन्स की एक और अधिक गहन सर्वेक्षण करने की जरूरत है, और synaptic इनपुट, न्यूरॉन्स premotor B4/B5 से और ट्रांसमीटरों, जो intracellular तकनीक की आवश्यकता के लिए प्रतिक्रियाओं के रूप में अतिरिक्त मापदंड की आवश्यकता हो सकती है.
उचित संशोधनों के साथ, इस तकनीक भी अन्य मोटर पूल के लिए लागू है, I5 मांसपेशी 10, I2 11 मांसपेशी, और I4 12 मांसपेशी Aplysia में या अन्य प्रणालियों के लिए उदाहरण के लिए, जैसे Lymnaea 2 stagnalis, हेलिक्स pomatia 3, 13 तिलचट्टा, और 14 zebrafish. उदाहरण के लिए, अगर एक में I5 मांसपेशी Aplysia (गौण radular करीब मांसपेशियों या 10,28 एआरसी के रूप में भी जाना जाता है) के लिए मोटर न्यूरॉन्स के लिए इस तकनीक को लागू करना चाहता है, एक मुख जन BN2s की बजाय संलग्न BN3s रखना चाहिए , क्योंकि I5 मोटर B15 न्यूरॉन्स और ipsilateral BN3 6,7 पर B16 परियोजना. तो टीवह मुख जन EMG या बल अध्ययन के लिए I5 मांसपेशी का पर्दाफाश करने के लिए तैयार रहना चाहिए. बाद न्यूरॉन्स मज़बूती से कम तैयारी में पहचान किया गया है, एक अनुकूलित निदान पद्धति भी भविष्य के व्यवहार के अध्ययन के लिए बनाया जा सकता है.
हम तकनीक वर्णित है बहु इलेक्ट्रोड arrays और वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों के रूप में अन्य बाह्य तकनीक के साथ कृपापूर्वक तुलना. वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई 29 तकनीक केवल रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि हमारे कोशिकी इलेक्ट्रोड और 30 arrays बहु इलेक्ट्रोड दोनों उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दोनों बहु इलेक्ट्रोड 29 सरणी और वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों 30 कई न्यूरॉन्स से संकेतों के साथ रिकॉर्ड कर सकते हैं. हालांकि एक एकल कोशिकी इलेक्ट्रोड केवल अपने टिप आकार और इलेक्ट्रोड स्थान के आधार पर एक या दो न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड कर सकते हैं, यह निश्चित रूप से संभव है नाड़ीग्रन्थि पर एक साथ कई स्थिति, और हम कुछ किया हैसफलतापूर्वक इस. इन विट्रो बहु इलेक्ट्रोड सरणी में मानक 8 8 x या 6 29 x 10 इलेक्ट्रोड है. चूंकि इलेक्ट्रोड सरणी में समान रूप से वितरित कर रहे हैं, यह अक्सर अंतर्निहित न्यूरॉन्स जिसमें से रिकॉर्डिंग प्राप्त कर रहे हैं, के बाद से न्यूरॉन्स नहीं समान रूप से वितरित कर रहे हैं, और महत्वपूर्ण संकेतों के बाद प्रसंस्करण, की पहचान की है जिनमें से कुछ अभी भी निर्धारित करने की चुनौती दे रहा है मैनुअल, इस अस्पष्टता को हल करने के लिए किया जाना चाहिए. इसके विपरीत, क्योंकि कोशिकी इलेक्ट्रोड एकल somata पर तैनात कर रहे हैं, न्यूरॉन के अंतर्निहित पहचान स्पष्ट है. इस प्रकार, यह लगता है कि है कि बहु इलेक्ट्रोड arrays और वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों कई युगपत रिकॉर्डिंग के लिए और अधिक कुशल हो सकता है. हालांकि, हमारे कोशिकी इलेक्ट्रोड तकनीक दोनों उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए बेहतर चयनात्मकता प्रदान कर सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस शोध NIH अनुदान NS047073 और NSF अनुदान DMS1010434 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).
