Summary
Hos dyr med store identifiserte nevroner (
Abstract
Hos dyr med store identifiserte nevroner (f.eks bløtdyr), analyse av motoriske bassenger er gjort ved hjelp intracellulære teknikker 1,2,3,4. Nylig har vi utviklet en teknikk for å ekstracellulært stimulere og ta individuelle nerveceller i Aplysia californica 5. Vi har nå beskrive en protokoll for å bruke denne teknikken for å identifisere og karakterisere motor nevroner i en motor pool.
Dette ekstracellulære teknikken har fordeler. Først ekstracellulære elektroder kan stimulere og registrere nevroner gjennom kappen 5, så det trenger ikke å bli fjernet. Dermed vil neuroner bli sunnere i ekstracellulære eksperimenter enn i intracellulære seg. Sekund, hvis ganglier roteres ved hjelp av egnede feste av kappen, kan ekstracellulære elektroder videre nevroner på begge sider av ganglion, som gjør det enklere og mer effektivt å identifisere flere nevroner i samme preparat. Tredje, extracelluLar elektrodene ikke trenger å trenge celler, og kan således lett flyttes frem og tilbake mellom nevroner, forårsaker mindre skade på dem. Dette er spesielt nyttig når man forsøker å ta opp flere nevroner i løpet gjenta motor mønstre som bare vedvare i minutter. Fjerde, ekstracellulære elektrodene er mer fleksible enn intracellulære dem under muskelbevegelser. Intracellulære elektroder kan trekke ut og skade nerveceller under muskelsammentrekninger. I kontrast, siden ekstracellulære elektroder er forsiktig presses på kappen ovenfor nevroner, de vanligvis bo ovenfor samme nervecellen under muskelsammentrekninger, og således kan anvendes i mer intakt preparater.
Å identifisere motoriske nevroner for en motor pool (i særdeleshet, I1/I3 muskel i Aplysia) ved hjelp av ekstracellulære elektroder, kan man bruke funksjoner som ikke krever intracellulære målinger som kriterier: soma størrelse og plassering, aksonal projeksjon, og muskel innervasjon 4, 6,7. For det bestemte motor pool for å illustrere teknikken registrerte vi fra bukkale nerver 2 og 3 for å måle aksonal anslag, og målte sammentrekning krefter I1/I3 muskel for å bestemme mønsteret av muskel innervasjon for den enkelte motor neurons.
Vi viser hele prosessen med først å identifisere motoriske nevroner bruker muskler innervasjon, så karakterisere deres timing under motor mønstre, lage en forenklet diagnostisk metode for rask identifisering. Den forenklede og raskere diagnostisk metode er overlegen for mer intakt forberedelser, for eksempel i den suspenderte buccal masse forberedelser 8 eller in vivo 9. Denne prosessen kan også brukes i andre motoriske bassenger 10,11,12 i Aplysia eller andre animalske systemer 2,3,13,14.
Protocol
1. Utarbeidelse av Recording Dish
- I løpet av kraft svinger eksperimenter, er buccal ganglia, cerebral ganglion, og buccal masse plassert i en runde Pyrex rett som er spesialisert for kraft studier.
- Å indusere ingestive-lignende mønstre i forsøkene, må vi bruke ikke-hydrolyserbar kolinerg agonist carbachol til cerebral ganglion 15. Å unngå direkte kontakt fra karbakol på buccal ganglier og bukkal masse, er separate kammere for å isolere den cerebrale ganglion fra bukkal ganglier og bukkale masse (figur 1).
- Siden buccale massen er mye tykkere enn den buccale ganglier, vil de ikke være plassert på samme nivå. Derfor bør denne parabolen har en rygg kammer for cerebral ganglion (område A på figur 1), en midtre plattform for bukkal ganglia (område C i figur 1), og en dypere fremre kammer for bukkal massen (område D i
- Å lage denne retten, begynner med en runde 100x15 Pyrex parabolen (15 mm høy, 100 mm i diameter). Bygging av parabolen vil kreve flere pours Sylgard. Følg instruksjonene som følger med Sylgard produktet. Sylgard må få lov til å sette mellom ulike pours.
- Den første pour er å skape det høyeste nivået av Sylgard i parabolen (område B på figur 1), som er veggen mellom mellomlaget plattformen og tilbake kammer.
- Bruk to modelleire backings å isolere området for Sylgard vegg (område B på fig 1). Pels modelleringsleire bakside med plastfolie hvor de vil kontakte Sylgard for enklere fjerning. Sikre tette lukene i kantene, der modellering leire vil kontakte parabolen, for å redusere faren for lekkasje.
- Hell Sylgard inn i den del mellom de to modellering leire backings nesten opp til toppen av parabolen. La Sylgard fullt satt over natten. Holde parabolen på et lunt sted vil indusereraskere innstilling. Fjern modelleringsleire bakside og rydde opp i eventuelle leire rester på Sylgard.
- Deretter bør baksiden kammeret (område A på figur 1) og den midtre plattformen (område C i figur 1) være strømmet.
- Plasser en modelleire backing ca 5 mm fra fremsiden av Sylgard for den delen av midtre plattform (område C).
- Hell Sylgard inn i seksjoner for ryggen kammer (område A) og midten plattform (område C) opp til en høyde på ca 3-5 mm under toppnivået av den første Sylgard veggen (område B). Den Sylgard overflate ryggen kammeret bør være litt lavere enn den midterste plattformen for å unngå lekkasje fra baksiden kammeret inneholdende karbakol til midten plattformen. Igjen, la Sylgard fullt satt over natten og deretter fjerne modelleire backing.
- Det siste trinnet er å kutte et hakk i midten av Sylgard veggen for å gi en kanal for den cerebrale-bukkale bindeord (cbcs) å gågjennom mellom mellomlaget plattformen og tilbake kammer. Bredden på denne hakk skal være omtrent 3-4 mm, som er bred nok for cbcs. Bunnen av hakk skal ikke være lavere enn den Sylgard overflate midten plattformen for å hindre lekkasje. En skalpell blad kan brukes til å kutte hakk.
2. Elektrode Forberedelse
- Trekk ekstracellulære glass elektroder fra single-barreled kapillær glass med en Flaming-Brown mikropipette avtrekker som beskrevet av McManus et al. 8 i avsnitt 3.1. Med FT345B filament i avtrekker, våre typiske programinnstillinger er Heat 480, Pull 50, Velocity 13, og Time 20, men merk at innstillingene vil være forskjellig for ulike filamenter. Dette programmet oppretter elektrodene i et enkelt trekk med ingen brann-polering scenen. Størrelsen på elektrodespissen bør være mindre enn størrelsen av cellen organer. For motoren nevroner fra 50 pm til 400 mikrometer i soma diameter, indre diameters av de ekstracellulære glass elektrodene bør være ca 40 um og deres motstand bør være omtrent 0,1 MΩ når de er fylt med Aplysia saltvann.
- Trekk sugekopper elektroder fra polyetylenrør med en bunsenbrenner. Klipp et stykke av polyetylen rør ca 10 cm lang. Hold slangen i begge ender og plassere den svært nær flammen generert av bunsenbrenner mens du roterer røret til den blir myk fra varmen. Strekk slangen forsiktig langs elva mens du flytter den vekk fra flammen. Den midtre delen av slangen vil langstrakte og smale som slangen trekkes.
- Skjær slangen i to for å danne to sugekopper elektroder. Sug elektroder er vanligvis brukt til kutt endene av nerver og muskler, selv om de kan noen ganger brukes en passant.
- Lag krok elektroder for nerve opptak etter protokollen beskrevet av McManus et al 8 i seksjoner 03.02 til 03.13. Disse elektrodene er especialliere nyttig når en nerve eller muskel ikke er kuttet.
3. Hook elektrode Vedlegg
- Dissekere dyr og fjern bukkalt masse fulgt protokollen beskrevet i McManus et al. 8 § 4.
- For opptak og stimulering, kan hekte elektroder festes til en rekke forskjellige nerver.
- Å karakterisere mønstre som ble gjort i vivo ved Cullins og Chiel 9, må opptakene hentes fra I2 nerve og muskel som indikerer protraction fasen av fôring 16, radular nerve (RN) som indikerer nedleggelsen av mat 17 grasper, bukkal nerve 2 (BN2) og buccal nerve 3 (BN3) som indikerer retraction fase 17,18. Festing av kroken elektroder følger en prosedyre lik den som er beskrevet av McManus et al 8, avsnitt 5.
- Lokaliseringen av disse nervene refererer til skjematisk av Aplysia fôring anordningen vist iFigur 2 av McManus et al 8. Merk at de BN2 trifurcates inn grener a, b, og c før du går under I1 muskelen på laterale sporet. Gren en er den første filialen å skille fra de viktigste stammen, og er ved siden av BN3.
- Nomenklaturen av filialer a, b, og c ble brukt av Warman og Chiel 18. Grener a, b og c svarer til grener 3, 2, og 1, respektivt, i den nomenklatur som brukes av Nargeot m.fl.. 19. Videre RN, BN1, den BN2 og BN3 tilsvarer nerver 1, 6, 5 og 4, respektivt, i nomenklatur brukes av Kandel 20 og Scott et al. 21
- For å studere muskel innervasjon av I1/I3 muskelen, alle nervene unntatt bukkale nerver 2 vil bli skilt fra den buccale massen under eksperimenter. Dermed brukte vi en krok elektrode å spille fra BN2. <li> Siden I2 nerve og RN ikke vil være knyttet til den buccale massen, og de er svært vanskelig å få tilgang til ved hjelp av krok elektroder, er det å foretrekke å påføre sugekraft elektroder til posten fra dem i stedet. Vi vil beskrive anvendelsen av sugekopper elektroder i § 7.
- Bruk enten en krok elektrode eller en suge elektrode å spille fra BN3, fordi det er lett å få tilgang til ved hjelp av enten type elektrode. Vi valgte å bruke en krok elektrode for BN3 opptak for å minimere antall manipulatorer for å holde suge elektroder, og for å spare plass til andre manipulatorer eller utstyr.
- Fest en krok elektrode til gren en av BN2 (BN2-a) å sette i gang avvisning-lignende mønstre i eksperimenter. Det er nyttig for å feste en ekstra krok elektroden til BN2-en på den andre siden, fordi noen neurons reagerer forskjellig på den ipsilaterale g. kontralaterale BN2-en stimulering.
- For å skille nevroner med ensidige vs bilateral anslag, deter også nyttig for å feste kroken til elektroder BN2 og BN3 på den andre siden av den buccale ganglier.
4. Ganglier og Muscle Forberedelse
- Bukkale ganglier, cerebral ganglion og bukkal massen vil være forberedt for force transducer eksperimenter, der cerebral ganglion er festet til den buccale ganglia via cbcs og bukkale massen er festet til den buccale ganglia via de BN2s bare.
- Etter å feste kroken elektroder, kuttet buccal nerve 1 (BN1) og esophageal nerve (EN) bilateralt, kutte på festepunktet til buccal masse.
- Trekk cerebral ganglion frem for å flytte den ut av veien for I2 muskel. Gjør et kutt i I2 muskelen over radular sac, forlenge kuttet sideveis og anteriorly i begge retninger, og trekk lokket til I2 muskel frem for å avsløre radular nerve. Skjær de to RN grener og sørge for at grenene er lange nok til å suge elektrode vedlegg.
- C, rediger I2 kutt i en vid krets rundt buccal ganglia, være forsiktig med å kutte BN2s eller BN3s, inntil bukkale ganglier og den vedlagte del av I2 muskel kan være fullt skilles fra buccal masse. Skjær de bilaterale BN3s på festepunktet til buccal masse, utover kroken elektroden vedlegg.
- Påfør et tynt lag med vakuum fett på hakk i opptaket parabolen beskrevet ovenfor som forbinder tilbake kammer og midtre plattform, ved hjelp av en pipette tips å plukke opp en glob av vakuum fett og spre den over hakk.
- Påføre et tynt lag av Quick-Gel superlim til glass bunnen av frontkammeret der buccale massen vil bli plassert, like foran Sylgard basen av midten plattformen.
- Nøye overføre cerebral ganglion, buccal ganglia og bukkal masse til opptaket parabolen (Figur 1) som beskrevet i § 2, og pass på at ingen av kroken elektrodene er trukket tett, noe som kan skade nerver.
- Plasser den bukkale massen på limet i frontkammeret av opptaket parabol, for å sikre at dens ventral overflate er limt til bunnen av skålen. Pass på å holde ganglier og elektroder fra berøre limet. Legg Aplysia saline 8 (460 mM NaCl, 10 mM KCl, 22 mM MgCl 2, 33 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2, 10 mM glukose, 10 mM MOPS, 7,4-7,5 pH) til parabol, som vil indusere limet å stille inn.
- Hvis parabolen må overføres til en annen mikroskop for å forberede buccal ganglia for ekstracellulære soma opptak, være svært forsiktig med krok elektroder. Gruppe elektrodene på den ene siden av den buccale massen sammen, og også gruppere elektrodene på den andre siden av den buccale massen sammen. Hold forsiktig elektrodene ved å holde i lab tape som dekker pinnene, igjen å sørge for at ingen av elektrodene er trukket tett.
- Når antenne er posisjonert under mikroskopet, elektrodenfiltre bør drapert forsiktig over sidene på skålen og hvile på plattformen ved til skålen.
- I pauser og mellom stadier av eksperimentet, lufte saltløsning i den buccale massen kammeret ved hjelp et akvarium airstone.
- Bruk pinsett for å ta tak i kappen cerebral ganglion og trekk den inn på baksiden kammer, slik at de cbcs kjøre gjennom hakk. Pin cerebral ganglion hjelp nerver enn de cbcs å unngå skade på de intakte cbcs.
- Påfør mer vakuum fett over cbcs, og deretter legge til flere Aplysia saltvann til begge kamre av parabolen, slik at ganglia er helt under vann. Påse at toppen av vakuum fett er litt høyere enn det Sylgard veggen slik at ingen lekkasje vil oppstå mellom kamrene.
- Å stabilisere den buccale ganglier, første pin endene av BN3s, deretter BN1s og ENS på Sylgard base av den midterste plattformen (figur 2). Siden BN3s vil bli registrert bruker kroken elektrodes, bør pinnene plasseres mer distalt enn festepunktene av kroken elektrodene.
- Bruk to pinner, bøyd 90 grader, som kroker å strekke og feste cbcs, slik at cbcs ikke blir skadet (figur 2).
- Pin ned RN grener mellom baksiden kammer og buccal ganglier. Deretter I2 muskel vil være på toppen av RNS. Å utsette I2 nerve, bruk pinsett å ta tak i I2 muskel og trekk den over buccal ganglia. Pin to hjørner av I2 muskel for å unngå skade på I2 nerve.
- Kutte I2 nerve distalt til det punkt hvor de to grener flette inn I2 muskelen. Kontroller at muskelen er fortsatt innerverte å være sammenlignbare med in vivo innspillinger. Skjær bort resten av I2 muskel og snu I2 nerve tilbake og pin den ned mellom de to RN grener (se figur 2, innfelt).
- Juster plasseringen av pinnene å strekke og legge spenning hvis en nerve er for løs, eller å frigjøre spenninger hvis en nerve er for stram. For ytterligere å stabilisere buccal ganglia, legge til flere pinner på kappen mellom nerver.
- Siden buccale ganglia er plassert caudal side opp, roter buccal ganglia hvis neurons av interesse er på rostral side. Å rotere en av de to bukkale ganglia, bruke fine pinsett for å ta noen overskytende kappen CBC der det er i nærheten av buccal ganglia og pin den ned mellom BN2 og BN3. I noen ganglia, kan det være mer praktisk å plassere den mellom CBC og BN3.
- Legge til en ekstra nål på kappen av den buccale ganglion på side nær til frontkammeret for å minimere bevegelsen av bukkal ganglion.
- Å trimme skjede dekker buccal ganglia, bruke fine pinsett til å ta tak i kappen på siden nær bak kammeret, og deretter klippe bort overflødig kappe med fine saks uten å utsette cellen organer. For å minimalisere skade bare fjerne det minimum av skjede nødvendig å se cellen organer.
- Etter than kappen buccal ganglia er trimmet, trekke I2 nerve og RNS over buccal ganglia og pin dem ned mellom buccal ganglia og fremre kammer til videre rotere buccal ganglia. (Se figur 2).
- Å vaske ut eventuelle gjenværende magnesiumklorid 8 som ble brukt til å bedøve dyret før disseksjon, erstatte Aplysia saltvann i parabolen med fersk Aplysia saltvann.
5. Elektrisk Koble Hook Elektroder
- Etter ganglia og muskel er forberedt, nøye overføre retten til vibrasjonsisolering tabellen for eksperimentene.
- Fest alle elektrodenåler til sine kontakter på BNC kabler som kobles til forsterkerne (AM Systems modell 1700 forsterker). Igjen, sørg for at elektrodene ikke er trukket tett mens du gjør dette. Kontroller at elektrodene er riktig festet til sine respektive kabler og at polene er korrekt. 6. Sette opp den ekstracellulære Glass Elektroder for Soma Recordings
- Fyll elektroden med Aplysia saltvann ved hjelp av en sprøyte koblet til et stykke polyetylenrør på rundt 15-20 cm. Fest fri enden av polyetylenrør til slutten av glasselektrode. Trekk tilbake på stempelet på sprøyten for å fylle opp elektroden med Aplysia saltvann.
- Plasser den fylte ekstracellulære glass elektrode i hakket på holderen på manipulator. Bruk manipulatoren å plassere elektroden spiss til Aplysia saltvann inneholdende den buccale ganglier.
- Sett en sølv / sølvklorid ledning loddet til en mannlig gull kontaktpinnen i elektroden for å tjene som opptak wire. Plasser en annen sølv / sølvkloridelektrode ledning loddet til en mannlig gull kontaktpinnen direkte i Aplysia saltvann i seksjonen av opptaket parabolen inneholder buccale ganglia å opptre som referanse wire. Koble både the-opptak og referanse ledninger til BNC kabel som kobles til forsterkeren.
- Hvis det er nok plass til flere manipulatorer, kan ytterligere ekstracellulære glass elektroder legges til spille inn flere nerveceller samtidig.
- Trimme den smale enden av inntaks elektrodespissen å matche diameteren av nerve. Den indre diameter av elektrodespissen bør være lik eller litt mindre enn nerve diameter for å sikre stram sugekraft.
- Siden I2 nerve og RN er svært nær hverandre, kan deres elektroder holdes av den samme manipulator for å spare plass. Plassere to elektroder i to hakk av samme holderen. Roter de to elektroder og sikre at deres tips er nær hverandre. Velge en av dem for I2 nerve opptaket, den andre for RN opptaket.
- Plasser elektroden spissen i Aplysia saltvann i Recording parabolen inneholder buccal ganglia. Fest fri enden av polyetylenrør på sprøyten for å suge elektroden. Bruke sprøyten for å fylle opp elektroden med Aplysia saltvann. Flytt elektrodespissen nær slutten av målet nerve, dvs. I2 nerve, og bruke sprøyten å suge nerven i elektroden. Lengden av nerve i elektroden bør være omtrent 0,5 til 1,0 mm for å sikre en tett forsegling.
- Gjenta suging for elektroden som vil bli festet til RN.
- Kobler elektrodene til de tilsvarende BNC kabler som beskrevet i pkt. 6.3.
- Å feste kraft transdusere til muskel, bruker silke suturer. Bøy buet nål av hver sutur, og knytte sutur til styrken svinger. Forsiktig grip og løfte en liten mengde av muskel med pinsett og, holder nålen i et annet sett med tang, settnålen gjennom muskelen opp til den bøyde punktet i nålen (Figur 1).
- Transdusere kan festes enten dorsalt eller lateralt på I1/I3 muskel. Dorsal vedlegg tillater måling av sammentrekninger fremkalt ved aktivering av enten venstre eller høyre side av muskelen. Lateral vedlegget viser sterkere krefter for flertallet av nevroner, men vil bare tillate måling av kontraksjon på den siden som svingeren er festet.
- For å identifisere nevroner som kan aktivere fremre, bakre, eller begge deler av I1/I3, feste en kraft svinger til den bakre delen av muskelen, bare anterior til svelget vev, og ved en annen kraft svinger til den fremre delen av muskel, på kjevene (Figur 1; Note kroker).
- Løft kraft transdusere før sting er trukket stramt, men ikke overbelastning. For å sjekke dette, se målingen fra kraften svinger når sutur har noen slakk i jegt, og løft deretter svinger før målingen er litt over dette baseline nivå.
- Denne protokollen beskriver en prosess for ekstracellulært identifisere motoriske nevroner i en motor basseng. Vi brukte AxoGraph programvare for å overvåke aktiviteten til enkelte nerveceller, flere nerver, og muskel (EMG-signal eller sammentrekning krefter). I denne protokollen, brukte vi sammentrekning krefter muskelen som en illustrasjon for prosessen med å identifisere motoriske nevroner, i andre forsøk, brukte vi EMG også, og oppsettet for slike eksperimenter er svært lik (se diskusjon).
- Å lokalisere en kandidat nevron, bruk manipulatoren å forsiktig trykk spissen av ekstracellulære glasselektrode ned på overtrekket over sentrum av neuron soma 5 (figur 3), som er den beste plasseringen for stimulering og registrering selektivitet 5. Siden terskelen gjeldende feller aktivere et nevron øker lineært med elektrode-til-soma avstand 5, vil stimulering selektivitet bli verre når elektroden beveges bort fra sentrum av målet nervecellen mot et nærliggende neuron.
- For å identifisere en motor neuron, først direkte stimulere nervecellen med ekstracellulære glasselektrode å sikre at bare denne nevron er avfyring, og undersøke om det innervates muskelen. Deretter ekstracellulært post fra dette nervecelle til å etablere en en-til-en forhold mellom den ekstracellulære soma opptak og nerve opptak, som også er avgjørende for neuron identifikasjon.
- Siden de fleste ekstracellulære forsterkere tillater ikke samtidig stimulering og opptak i en kanal, sette den kanalen som brukes til å stimulere og ta opp soma (soma kanal) til stimulering modus og bruke en kort anodisk strøm (f.eks 6 msek for Aplysia nevroner 5) til soma (Tall 4A, 5A, note piler en in begge tall), fra en lav strøm (dvs. 200 μA), og gradvis øke strøm til nervecellen bursts.
- Når Nevron er aktivert til å sprekke, bør man umiddelbart bytte soma kanalen fra stimulering modus til opptaksmodus (Fig. 4A, 5A, note piler 2 i begge tall). Det vil imidlertid fortsatt være forsinkelser mellom soma stimulering og registrering på grunn av menneskelig reaksjon forsinkelser.
- Dersom neuron branner for en rimelig tid, bør det være mulig å observere en-for en-tilsvarende aksjonspotensialer fra soma opptak og på nerven (e) gjennom hvilken Nevron prosjekter (Tall 4b, 5b; Note stiplede linjer ), samt kreftene som genereres av neuron (Fig. 4A, 5A; Note Blue bokser). Hvis nervecellen stopper avfyring før soma opptaket begynner, øke dagens aktivere den for en lengre tid.
- Signal-til-støy-forhold på den ekstracellulæreopptak avhenger elektroden plassering og soma størrelse. Ekstracellulære opptak vil bli større som soma størrelse øker og elektrode-til-soma avstand reduseres. Siden støy bare varierer i et smalt område, vil signal-til-støy-forhold også øke etter hvert som soma størrelsen øker og den elektrode-til-soma avstand avtar. Den vanligste spekter av signal-til-støy-forholdet er 04:01 til 08:01.
- De motoriske nevroner kan identifiseres basert på deres egenskaper, for eksempel soma beliggenhet, nerve projeksjon og muskel innervasjon 4,6,7. Siden bare de to BN2s er festet til buccal massen, ved å overvåke aktiviteten på BN2s, kan en sikre at muskelkontraksjon kraft bare forårsaket av neuron aktivert av ekstracellulære stimulering.
- For eksempel er en stor motor B3 nevron for I1/I3 muskelen (300-400 mikrometer i soma diameter hos dyr som veier 200 til 350 gram), som ligger på den side av rostral buccale ganglion (Figur 3
- Etter en nevron er identifisert, kan dens aktivitet bli registrert i forskjellige mating-lignende oppførsel via ekstracellulære glasselektrode (Figurene 4 og 5), som kan utløses som beskrevet nedenfor. Den ekstracellulære opptak på soma vil være mye mer konkret enn nerve opptak, som inkluderer aktiviteten av mange forskjellige nerveceller.
- Å indusere egestive-lignende motor programmer, stimulere BN2-en med 1-2 min pulser 19 (2 Hz, er hver puls 1 ms). Dette stimulering genererer pålitelig egestive mønstre i denne innstillingen. Med tilstrekkelig strøm (f.eks 300 μA), kan mønstrene vedvare for varigheten av stimulering. Noen ganger vil det være en mer mønster som oppstår kort tid etterstimulering ender.
- Å indusere ingestive-lignende motor programmer, legger du et par krystaller av solid carbachol direkte på kappen cerebral ganglion 15. Hvis man ønsker å kontrollere nivået av karbakol eksponering, bruke en løsning av 1-10 mM karbakol i Aplysia saltvann. Høyere konsentrasjoner er mer sannsynlig å indusere svar. Repetitive mønstre generelt begynner i løpet av fem minutter, og kan vare i omtrent ti til femten minutter før du begynner å kjøre.
- Etter vask ut karbakol flere ganger og venter i minst 30 min, kan en etterfølgende anvendelse av karbakol legges til den cerebrale ganglion å indusere flere ingestive-lignende motoriske mønstre.
- Etter flere motoriske nevroner for den aktuelle motor bassenget har blitt identifisert og karakterisert ved motoriske programmer, kan man utvikle en sterkt forenklet diagnostisk metode som krever minimalt med informasjon for raskt å identifisere disse nevronene i det videre arbeidet (figur 6 </ Strong>), for eksempel i de suspenderte bukkale masse forberedelser eller in vivo. Kriteriene kan omfatte soma størrelse og plassering, nerve projeksjon, enhet størrelse på nervene, og tidspunktet for aktivitet under motor mønstre.
7. Sette opp Suction Elektroder for nerve Recordings
8. Sette opp Force Svinger til Mål I1/I3 muskelkontraksjon
9. Identifisere motor nevroner i en Motor Pool
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurene 4 og 5 viser typiske resultater brukes til å identifisere to I1/I3 motoriske nevroner. Figur 4 viser de soma opptak av en stor motor neuron, B3, under egestive-lignende og ingestive-lignende mønstre (Tall 4C, 4D). En-til-en tilsvarende spisser på soma-kanalen og den ipsilaterale BN2 kanalen (figur 4E) viser at det spesielle ved B3 soma opptaket ble opprettholdt under mønstre. B3 branner under midten til slutten av tilbaketrekkingen fasen av mønstrene. Fra figur 4 og andre resultater (ikke vist), har vi funnet at BN2 enhet B3 er alltid den største BN2 enhet. Dermed kan det også påvises direkte fra BN2 innspillinger.
Figur 5 viser de soma opptak av en liten nevron, B43, under egestive-lignende og ingestive-lignende mønstre (Tall 5C, 5D). En-for en-tilsvarende spisser på soma-kanalenog den ipsilaterale BN2 kanalen (figur 5E) viser også at det spesielle ved B43 soma opptaket ble opprettholdt under mønstre. Nevron B43 bursts på slutten av tilbaketrekkingen fasen under mønstre. Siden BN2 enhet B43 er liten, ville det være vanskelig å identifisere det fra BN2 innspillinger uten soma opptak, men fordi den avfyres mest intenst ved utløpet av den BN2 motor mønster, kan slutten av B43 s burst fremdeles identifiseres fra BN2 opptak alene.
Figur 6 viser et optimalisert diagnostisk tre som ikke krever muskel innervasjon som kriterium, noe som gjør det mye enklere å ekstracellulært identifisere I1/I3 motoriske nevroner i den suspenderte bukkale massen forberedelse eller in vivo. Den diagnostiske treet ble utviklet, men ved å bruke målinger av kraft og EMG, og dermed illustrerer hvordan teknikkene i denne protokollen kan føre til strømlinjeformet motoriske nevroner identifisering.
Figur 1. Skjematisk av generelle oppsett og parabolen for kraft studier. Den øverste bildet viser en topp utsikt. Den nederste bilde viser et sideriss (tilsvarende den stiplede linje i midten av den ovenfra). Cerebral ganglion er festet til Sylgard i ryggen kammer (område A). Bukkale ganglia er festet til Sylgard på midten plattformen (område C). Baksiden kammer og midtre plattform er adskilt med en forhøyet Sylgard vegg (område B). De cerebral-bukkale bindeord (cbcs) passerer gjennom et hakk i Sylgard veggen, forseglet med vakuum fett. Bukkale massen er limt til glasset bunnen av frontkammeret (område D). De bukkale nerver 2 (BN2s) er festet til den buccale masse. To kroker festet til silke suturene er innsatt inn i de fremre og bakre områder av I1/I3 muskel. Than silke suturene er deretter bundet til kraften svingeren. Figuren bruker mørk grå, lys grå og hvit til indikere overflatene av områdene A, B, C og D. Den mørkere farge, jo høyere den tilsvarende overflate. Figuren bruker en, b, c, og d for å angi viktige dimensjoner parabolen. Lengde a er 3-4 mm, bredden av hakket som forbinder baksiden kammer og midtre plattform. Lengde b er ca 3-5 mm, høydeforskjellen mellom overflatene av den midterste plattformen (område C) og Sylgard veggen (område B). Lengde c angir lengden av hakket, som er omtrent 5 mm. Lengde d viser bredden av den midtre plattformen (område C), som er omtrent 5 mm.
Figur 2. Skjematisk av bukkal gangliaog elektroder oppsett. Figuren viser plasseringen av viktige nerver, inkludert bukkale nerver 1, 2 og 3 (BN1, BN2, og BN3), esophageal nerve (EN), den radular nerve (RN), I2 nerve og muskel og cerebral buccal connective (CBC). Legg merke til at BN2s er festet til den buccale masse (se figur 1). De cbcs er festet til cerebral ganglion, passerer gjennom hakket i Sylgard vegg og er forseglet med vakuum fett (se figur 1). RN og I2 nerve og muskel trekkes over ganglier og låste proksimalt for buccal masse (fremre retning). Blå linjene indikerer plasseringen av pinnene. To bøyde pins (røde linjer merket 1) brukes for å feste de cbcs. Merk at en klaff av kappen CBC på venstre side er foldet og låste ned mellom BN2 og BN3 å rotere venstre bukkal ganglion (rød linje merket 2). I noen ganglia kan det være mer praktisk å feste kappen ned mellom CBC og BN3. En ekstra pin er lagt to siden av ganglion som er proksimalt til EN (rød linje merket 3) for ytterligere rotasjon og stabilisering. Det ekstracellulære glasset elektrode plasseres på toppen av kappen over soma for ekstracellulære stimulering og registrering. Kroken elektrodene er festet til BN3s og pinnene som holder disse nervene på plass bør plasseres mer distalt enn festepunktene av disse krok elektroder. To sugekopper elektrodene er festet til RN og I2 nerve og muskel (se innfelt for en klarere visning av I2 nerve og muskel). Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Et bilde og skjematisk av nervecellen kartet for ekstracellulære identifisering av I1/I3 motornevroner i Aplysia buccal ganglion. Det øverste bildet viser en høyre side buccal ganglion, låste caudal side opp. Å rotere bukkale ganglier, RN og I2 nerve / muskel trekkes over den buccale ganglier og låste proksimalt for siden av EN. En klaff av CBC kappe er også foldet og festet for dreining (se figur 2), slik at nevroner ved rostral siden eller på kaudal / rostral kant kan ses. Bunnen skjematisk blir tegnet basert på det øverste bildet. Bildet og skjematisk sammen indikerer plasseringen av I1/I3 motor neurons B3, B6, B9, B10, B38, B39, B43 6,7 og B82 22,23, samt noen andre nerveceller. Nevroner B8a og B8b er ansvarlig for den største enheten på RN, og innerverer muskelen I4 kontrollere grasper 6,17. Nevroner B4 og B5 er ansvarlig for den største enheten på BN3 18. Selv om størrelser og plasseringer av de I1/I3 motoriske nevroner er variabel fra dyr to dyr, de relative størrelser og plasseringer er ganske pålitelige for de fleste nevroner: B3, B6, B9, B38, B43, og B82. Se diskusjon for mer informasjon om de I1/I3 motoriske nevroner, spesielt noen av vanskelighetene med unik identifisering B10 og B39.
Figur 4. Identifisere og karakterisere I1/I3 motor neuron B3. A) Extracellular stimulering av B3 (ved pilen 1) og opptak fra B3 soma (som starter på pil 2), samt fra de tilsvarende nerver og muskel regioner. Fra topp til bunn, kanalene er opptak fra B3 soma, kontralaterale BN2, den ipsilaterale BN2, den ipsilaterale BN3, sammentrekning kraft av fremre område av I1/I3 muskelen og kontraksjonskraften av bakre region av I1/I3 muskel. Denblå boks fremhever varigheten av krefter i de fremre og bakre regioner i I1/I3 muskel. I dette spesielle tilfellet, er den bakre kraft større enn fremre kraft. B) Utvidet utsikt over området skissert av den røde boksen i A1. En-til-en tilsvarende aksjonspotensialer i B3 soma og iBN2 kanalene viser at B3 bare prosjekter på ipsilaterale BN2. C) Extracellular opptak fra B3 soma og nerver i en egestive-lignende motor mønster. D) Extracellular opptak fra B3 soma og nerver i en ingestive-lignende motor mønster. I C og D, fra topp til bunn, kanalene er opptak fra B3 soma, I2 nerve, RN, den ipsilaterale BN2, og den ipsilaterale BN3. De blå boksene viser protraction og tilbaketrekning faser av mønstrene. De røde søylene i B3 soma kanal i både C og D markere handlingen pottenentials registrert fra B3 soma. De røde søylene i iBN2 kanal i både C og D viser den tilsvarende timing når B3 er avfyring i den ipsilaterale BN2 under fôring motor mønstre. E) Utvidet visning av B3 soma og iBN2 kanaler som er merket med den røde søyler. De stiplede linjene viser en-til-en-forhold mellom aksjonspotensialer i B3 soma og iBN2 kanaler. Legg merke til at BN2 enhet B3 er den største av alle enheter. Dermed kan vi også oppdage BN2 enheter av B3 direkte fra BN2 opptak uten soma opptak. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Identifisere ogkarakteriserer I1/I3 motor neuron, B43. A) Extracellular stimulering av B43 (ved pilen 1) og opptak fra soma sin (som starter på pil 2), samt fra de tilsvarende nerver og muskel regioner. Fra topp til bunn, kanalene er opptak fra B43 soma, kontralaterale BN2, den ipsilaterale BN2, den ipsilaterale BN3, sammentrekning kraft av fremre delen av I1/I3 muskel, og sammentrekning kraft bakre delen av I1/I3 muskel. Den blå boksen fremhever kraft målinger av I1/I3 muskel under B43 aktivitet. Aktiverende B43 genererer en liten posterior kraft, men ingen anterior kraft. B) Utvidet utsikt over området skissert av den røde boksen i A. De stiplede linjene viser en-til-en-forhold mellom aksjonspotensialer i B43 soma og iBN2 kanaler, noe som indikerer at B43 prosjekter på ipsilaterale BN2 bare. C) Extracellular opptakfra B43 soma og nerver i en egestive-lignende motor mønster. D) Extracellular opptak fra B43 soma og nerver i en ingestive-lignende motor mønster. I C og D, fra topp til bunn, kanalene er opptak fra B43 soma, I2 nerve, RN, den ipsilaterale BN2, og den ipsilaterale BN3. De blå boksene viser protraction og tilbaketrekning faser av mønstrene. De røde søylene i B43 soma kanal i både C og D markere aksjonspotensialer registrert fra B43 soma. De røde søylene i iBN2 kanal i både C og D viser den tilsvarende timing når B43 er avfyring i den ipsilaterale BN2 i disse mønstrene. E) Utvidet visning av B43 soma og iBN2 kanaler som er merket med den røde linjen i D. De stiplede linjene viser en-til-en-forhold mellom aksjonspotensialer i B43 soma E er en kollisjon av en B43 soma enhet med en annen ekstracellulære enhet. Klikk her for å se større figur .
Figur 6. Den optimaliserte diagnostisk treet for å identifisere noen av de I1/I3 motoriske nevroner bruker ekstracellulære soma og nerve opptak. Denne diagnostiske metoden krever minimalt med informasjon for å identifisere de I1/I3 motoriske nevroner, noe som gjør det mye enklere å identify motoriske nevroner i den suspenderte bukkale massen forberedelse eller in vivo. B3 har den største BN2 enhet blant de identifiserte I1/I3 motoriske nevroner. I resten av motoren nevroner, B6 og B9 er de to eneste nevroner som prosjektet både BN2 og BN3. B9 er mer lateral enn B6. Resten av nevroner fremspringende bare på BN2 kan også deles i to grupper. En gruppe nevroner prosjekter bilateralt gjennom BN2s, som inkluderer B10 og B39 og noen ukjente nevroner. Den andre gruppen av nerveceller prosjekter ipsilaterally på BN2 bare, som inkluderer B38, B43, og B82. B38 er nær B3 og B9. B82 er nær B8 (se Figur 3). B43 er nær B6. Dens BN2 enheten er liten og spenningstopper ved slutten av fôring mønstre.
Figur 7. Sammenligning av suksessrate på neuron identification under force forsøk med enten ekstracellulære teknikk eller den intracellulære teknikk. med samme kraft svinger oppsett, gjorde vi 35 forsøk med ekstracellulære teknikk (små blå prikker) og 27 forsøk med konvensjonelle intracellulær teknikk (store lilla prikker) for å identifisere I1/I3 motor nevroner. Den x-aksen angir minste antall motoriske nevroner for I1/I3 muskel som ble identifisert i hver type eksperiment. Y-aksen viser den prosentvise suksessrate på hver type eksperiment. For eksempel, i 19 ut av 35 (54%) av de ekstracellulære eksperimenter, var vi i stand identifisere minst fem forskjellige I1/I3 motoriske nevroner. I bare 1 av 27 (4%) av de intracellulære eksperimenter, var vi i stand til å identifisere minst fem I1/I3 motoriske nevroner. Det er klart at suksessraten identifisere nevroner er mye høyere for en gitt antall nevroner bruker ekstracellulære teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hos dyr med store identifiserte nevroner, som bløtdyr (f.eks Lymnaea, Helix og Aplysia), analyse av motoriske bassengene gjøres typisk ved hjelp av intracellulær innspilling 1,2,3,4. I denne protokollen, beskriver vi en fremgangsmåte for entydig identifikasjon av motoriske nevroner etter en motor basseng ved hjelp av en ekstracellulær teknikk. Vi brukte kraft målinger som en illustrasjon på denne prosessen. Man kan også bruke EMG å måle muskel innervations. Kort, for å gjøre det, må protokollen endres for å feste krok elektroder til forskjellige regioner i I1/I3 muskel for EMG opptak.
Det ekstracellulære teknikken har visse fordeler fremfor intracellulære teknikker, hvorav noen allerede er beskrevet ovenfor. Først krever det ekstracellulære teknikk mindre tid og krefter på å forberede ganglia for eksperimenter og vil forårsake mindre skade nerveceller. Vanligvis vil det ta 20-30 minutter å forberede buccal ganglia for ekstracellulære eksperimenter og ca 1,5 hr å forberede den buccale ganglia som er festet til den buccale masse for intracellulære eksperimenter. Siden musklene blir mindre aktiv som tiden går, kan det hende at tidsforskjellen mellom ganglia forberedelsene til ekstracellulære eksperimenter og intracellulære seg være avgjørende for å lykkes med eksperimenter. Figur 7 viser sammenligning av suksessraten for å identifisere de motoriske nervecellene for I1 / I3 muskel bruker ekstracellulært eller intracellulære teknikk i kraft studier. I alle 35 ekstracellulære force eksperimenter (100%), var vi i stand til å identifisere minst en motor nervecellen for I1/I3 muskel. I 31 ut av 35 (89%) ekstracellulære eksperimenter, var vi i stand til å identifisere minst tre I1/I3 motoriske nevroner. I 19 av 35 (54%) ekstracellulære eksperimenter, kunne vi identifisere minst fem forskjellige I1/I3 motoriske nevroner. I kontrast til suksessrate den intracellulære eksperimenter med same force svinger oppsett var lavere. I 23 av 27 (85%) intracellulære eksperimenter, var vi i stand til å identifisere minst én I1/I3 motor neuron. I 8 av 27 (30%) intracellulære eksperimenter, var vi i stand til å identifisere minst tre I1/I3 motoriske nevroner. På bare ett av 27 (4%) intracellulære eksperimenter, var vi i stand til å identifisere fem I1/I3 motoriske nevroner. Således er sannsynligheten for å identifisere flere nevroner i samme ganglion høyere hjelp ekstracellulære teknikker i motsetning til intracellulære teknikker.
I tillegg kan det ekstracellulære teknikken videre mange neuroner på begge sider av ganglia i samme eksperiment. Vanligvis, etter desheathing kan intracellulære elektroder kun tilgang nevroner på siden av ganglion som har blitt desheathed. For eksempel, når en av de to bukkal ganglia (f.eks hemiganglion på venstre side) er festet caudal side opp, vil det være enkelt for intracellulære elektroder å få tilgang til nevroner på atside av ganglion, B6 f.eks B9, B10, B39, og B43, men vanskelig å få tilgang til nervecellene på rostral side av ganglion, som B4, B5 B8a, B8b, B38 og B82. I kontrast, kan ekstracellulære elektroder videre mange neuroner på begge sider av samme bukkal ganglion med hensiktsmessig rotasjon av ganglion. Graden av rotasjon er justerbar og reversibel. Dette øker også sannsynligheten for å identifisere flere nevroner i samme ganglion.
Siden ekstracellulære elektroder er forsiktig presses mot skjede dekker nervecellene, vil disse elektrodene ikke trekkes ut av nerveceller, noe som kan skape store hull i membranen og forårsake skade, forekommer som med intracellulære elektroder under muskelbevegelser. Signalet størrelse vil variere ettersom ganglia flytte i løpet av de muskelbevegelser. Vær oppmerksom på at noen ganger under store muskelbevegelser, vil ekstracellulære soma opptak signaler reduseres eller går tapt. Men vi kan lett move det ekstracellulære elektroden tilbake på nevron og gjenopprette de opprinnelige signaler. Dette gjør det mulig å anvende det ekstracellulære teknikken til suspendert bukkale massen forberedelse 8 for atferdsstudier, hvor musklene genererer store sammentrekninger som forberedelse genererer forskjellige atferdsresponser. For eksempel, i 47 ut av 48 suspenderte bukkale masse eksperimenter (98%), var vi i stand til å identifisere minst en motor neuron for I1/I3 muskel. I 23 av 48 (48%) suspendert bukkale masse eksperimenter, var vi i stand til å identifisere minst tre I1/I3 motoriske nevroner. I 11 av 48 (23%) suspendert bukkale masse eksperimenter, var vi i stand til å identifisere minst fem motoriske nevroner for I1/I3 muskel og ta fra dem i løpet av motor mønstre som buccal massen ble utført fôring-lignende atferd. Det ekstracellulære teknikk er også gjeldende for andre mer kompliserte semi-intakte preparater, slik som de isolerte hodet fôring preparater som inkluderer tHan tentakler, lepper, kjeve, buccal masse, buccal ganglier, og cerebral ganglion 12,24,25,26. Siden sanseinntrykk er svært viktig for å frembringe foring atferd i slike preparater, vil det ekstracellulære teknikken være spesielt nyttig på grunn av sin enkelhet og mindre skadelige egenskaper. Tidligere studier viser også at det er mulig å identifisere og kronisk posten B4/B5 in vivo 18. I disse tidligere eksperimenter, etterforskere brukte svakstrøm (10-20 μA) BN2-en stimulering til selektivt aktivere B4/B5 og limt en kort polyetylen rør til kappe over B4/B5 for opptak, ble der satt inn et par twisted rustfritt stål ledninger. Dermed er det også mulig å identifisere og registrere fra motoriske nevroner in vivo ved hjelp av polyetylen rør elektroden som er limt på skjede dekker ganglia (Chestek og Chiel, upubliserte resultater).
Ekstracellulære teknikken har også noen limitationer. Første, vil det være vanskelig for ekstracellulære elektroder å stimulere eller registrere nevroner som er for små eller for dypt inne i ganglion. Merk at det fortsatt er mulig å aktivere neuroner som ikke er på overflaten via ekstracellulære stimulering. Imidlertid har vår modell 5 viste at stimulering kan miste spesifisitet når målet neuron er dypere enn de nærliggende nerveceller. Når neuron er dypere, vil elektrode-til-soma avstand være større og høyere strøm vil være nødvendig for å aktivere denne nevron, som kan være høy nok til å aktivere andre overflate nevroner nærheten. Sekund, hvis et nevron stimuleres ekstracellulært med for mye strøm, kan det bli skadet og ikke lenger reagere, mye mindre strømmer brukt i intracellulær stimulering, skjønt for mye strøm intracellulært kan også skade nerveceller. Iblant soma opptaket vil omfatte flere enheter fra både mål nevron og tilstøtende nerveceller, som er mindre spesifikke enn intracellular opptak. I tillegg kan det være vanskeligere å nøyaktig kontrollere og overvåke avfyringsfrekvens av et individ neuron med ekstracellulære stedet intracellulære teknikk, fordi det ekstracellulære elektroden ikke kan stimulere og registrere samme neuron samtidig. Videre vil det ekstracellulære teknikken ikke kunne spille den synaptiske innspill fra premotor nerveceller. I tillegg kan det være vanskelig å anvende nevrotransmittere iontophoretically til en bestemt nevron mindre ganglion er desheathed, selv om vi har vist at det er mulig å stimulere en ganglion hjelp karbakol uten å fjerne kappen 27.
Begrensningene ekstracellulære identifikasjon teknikker gjort noen nevroner i verkstedet vanskelig å identifisere. I dette spesielle eksempel, det ekstracellulære teknikken pålitelig identifiseres fleste motoriske nevroner for I1/I3 muskel i Aplysia: B3, B6, B9, B38, B43, og B82, basert on soma størrelse og plassering, nerve projeksjon, og muskel innervasjon. Imidlertid har vi ikke vært i stand til å pålitelig identifisere B10 og B39. Forrige intracellulær arbeid 6,7 viste at B10 og B39 er to tilstøtende nerveceller på kaudal side av bukkal ganglier, mellom B4/B5 regionen og B6 regionen. Begge nevroner prosjektet bilateralt på de BN2s. B10 innervates midten og posterior region av I1/I3 muskel, mens B39 innervates fremre området av I1/I3 muskel. Basert på soma plassering og nerve projeksjon kriterier, fant vi mer enn to motoriske nevroner som prosjektet bilateralt bort på de BN2s i fire forskjellige eksperimenter. Siden deres soma steder, muskel innervations og timing av aktivitet under motor mønstre var variabel fra dyr til dyr, vi var ikke sikker på om de var de samme nervecellene. Dermed var vi ikke i stand til å pålitelig identifisere B10 og B39 med ekstracellulære teknikk på grunn av mangel på konsistens. Å identifisere dem,vi trenger å gjøre en mer grundig undersøkelse av nevroner i buccal ganglia, og kan trenge flere kriterier, som for eksempel den synaptiske innspill fra premotor nevroner B4/B5, og svarene til sendere, som krever intracellulære teknikker.
Med passende modifikasjoner, er denne teknikken også gjeldende for andre motoriske bassenger, f.eks I5 muskel 10, I2 muskel 11, og I4 muskel 12 i Aplysia eller til andre systemer, f.eks Lymnaea 2 stagnalis, Helix 3 pomatia, 13 kakerlakk, og sebrafisk 14. For eksempel, hvis man ønsker å bruke denne teknikken til motoriske nevroner for I5 muskelen (også kjent som tilbehør radular nærmere muskler eller ARC 10,28) i Aplysia, bør man holde BN3s knyttet til bukkale masse i stedet for BN2s , fordi I5 motoriske nevroner B15 og B16 prosjekt på ipsilaterale BN3 6,7. Deretter than buccal masse bør være forberedt på å eksponere I5 muskel for EMG eller tving studier. Etter nervecellene er stemt pålitelig identifiseres i den reduserte forberedelser kan en optimalisert diagnosemetode også opprettes for fremtidige atferdsstudier.
Teknikken vi har beskrevet sammenligner gunstig med andre ekstracellulære teknikker som multi-elektrode arrays og spenningssensitive fargestoffer. Spenning-følsomme fargestoff 29 teknikk er kun brukt til opptak, mens vårt ekstracellulære elektroder og multi-elektrode arrays 30 kan brukes for både stimulering og registrering. Både multi-elektrode array 29 og spenningssensitive fargestoffer 30 kan ta opp signaler fra mange nerveceller samtidig. Selv om en enkelt ekstracellulære elektrode kan bare ta opp fra én eller to nevroner avhengig spissen størrelse og elektroden plassering, er det absolutt mulig å plassere flere på en ganglion samtidig, og vi har gjortdette med hell. Standard i vitro multi-elektrode array har 8 x 8 eller 6 x 10 elektroder 29. Siden elektrodene er jevnt fordelt i matrisen, er det ofte en utfordring å fastslå identiteten av de underliggende nevroner fra hvilke opptak er oppnådd, siden nervecellene ikke er jevnt fordelt, og betydelige etterprosessering av signalene, hvorav noen fortsatt er manuell, må gjøres for å løse dette tvetydighet. I kontrast, fordi de ekstracellulære elektrodene plasseres over enkelt somata, er identiteten av den underliggende neuron klart. Dermed virker det som multi-elektrode arrays og spenningssensitive fargestoffer kan være mer effektiv for flere samtidige opptak. Imidlertid kan vår ekstracellulært elektrode teknikk gi bedre selektivitet for både stimulering og registrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av NIH stipend NS047073 og NSF stipend DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).
