基因表达的变化大鼠海马后，前丘脑核脑深部刺激分析

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

深部脑刺激（DBS）的手术，靶向脑的各个区域，例如基底神经节，丘脑和丘脑底区域，是一种有效的治疗该未能对药物响应的几个运动障碍。在DBS外科领域的最新进展已经开始扩展这个手术技术的其他条件等不同的病态肥胖，抑郁症和强迫症的应用。尽管有这些迹象不断扩大，鲜为人知的是，潜在的生理机制，以促进DBS手术的有利影响。一种方法这个问题是在接受电刺激的神经元进行基因表达分析。以前的研究已经表明，神经发生在大鼠海马齿状回被引发在DBS丘脑¹的前核的定位。 DBS手术针对ATN被广泛用于治疗难治性癫痫。因此，这是多大的INTERES吨为我们探索诱发电刺激ATN的转录变化。在这个手稿中，我们描述了立体定位引导下DBS手术针对ATN成年雄性Wistar大鼠我们的方法。我们还讨论了组织解剖，RNA分离，cDNA的制备和定量RT-PCR的随后步骤，用于测量基因表达的改变。这种方法可用于修改用于刺激基底节和脑的其它区域通常临床目标。这里所描述的基因表达研究假设的发现分子球员可以指挥机制DBS一个候选目标基因的方法。

Introduction

背后深部脑刺激的发展作为一个神经外科技术的历史可以追溯到19世纪70年代时的电刺激大脑电路的可能性进行了探讨^2。采用慢性高频刺激作为治疗神经疾病始于20世纪60年代^3。后来在上世纪90年代慢性植入电极DBS ^4-6的来临，这是由DBS治疗神经疾病的人数不断增加。深部脑刺激，第一次在美国用作用于原发性震颤⁶的处理。今天的手术被广泛用于治疗神经元疾病是目前无法治疗由药物干预。 DBS是目前用于治疗帕金森氏病和肌张力障碍^7-9的运动障碍。阿耳茨海默氏型痴呆，亨廷顿氏病，癫痫症，疼痛和神经精神疾病，例如抑郁症，强迫症，图雷特7综合症和成瘾是一些适合治疗由DBS ^10-12的条件。而DBS手术是FDA批准的用于治疗帕金森氏症，肌张力障碍和原发性震颤，利用DBS用于治疗上面提到的其他条件都在实验室将提供很大希望给患者^13,14的各个阶段和临床研究。

在临床上，DBS手术是在两个阶段中进行。使用放射性定位的组合的第一阶段包括通过外科手术定位DBS电极在所述靶向解剖结构的位置，CT，MRI以及微电极读数提高精度。第二阶段涉及植入在病人的胸部上的脉冲发生器和从头皮到脉冲发生器安装延伸引线。基于所述神经系统疾病，用于脉冲发生器编程几个方案已被标准化，并将被用来提供所需的电压。最终卷塔格达到以逐步的方式，以便接收与 ​​最小电压¹⁵的最好的临床响应。然而，在我们的研究中，不像慢性DBS植入物应用于临床，为简单起见，我们已采取在我们的动物模型研究的一次性高频刺激（1小时）。

我们组的研究的一部分集中在研究使用DBS手术治疗难治性癫痫。采用高频电刺激立体定向手术方法已探索了许多人作为一种有效的选择治疗构成约30％的癫痫^10,16,17的各个发病的医学难治性癫痫。小脑刺激靶向皮质表面以及深层小脑核已经使用在过去作为目标，以治疗癫痫^10,18,19。此外，海马的刺激也已试过，但用不同的结果^20,21。一些其它的研究DBS目标癫痫包括大脑皮质，丘脑，丘脑下核和迷走神经^8。然而，从在过去的几年中的几项研究，结果如下，前丘脑核（ATN）已经成为最常见的DBS目标为癫痫的治疗^10,22。建立在有关神经解剖学电路和从动物模型的研究结果，一些研究已经在治疗癫痫^23-26集中的ATN的深部脑刺激的治疗效果。使ATN是边缘电路的一部分，并位于影响发作频率的大脑区域。所学专业哈马尼等人 ，已经测试ATN-DBS的疗效在毛果芸香碱诱发癫痫模型，发现双侧ATN刺激潜伏期延长的毛果芸香碱诱发的癫痫发作和癫痫持续状态^24。此外，ATN的高频刺激发现，以减少在戊四氮（PTZ）模型EP的发作频率ilepsy ^25,27-29。 Lee 等人 ，已经报道经ATN慢性脑深部刺激的平均降低发作频率由约75％在治疗顽固性部分癫痫^30。

在治疗难治性癫痫最近的临床研究表明DBS手术后有希望的结果针对前丘脑核^{（ATN）22。}多中心的随机临床试验110例患者接受了ATN的双边DBS治疗难治性癫痫（SANTE试行）表示癫痫发作频率下降了约^40％31。从本研究的结果还暗示上在2-3个月后的手术观察延迟最优抗癫痫作用。户田等人的进一步研究。，证实与这些发现，他们表现出神经发生发生在稍后的时间交 ​​的DBS（3-5天）在动物模型^1。此外，恩西纳斯。等，已经报道海马neurogene矽统后的ATN ³²的高频刺激成年小鼠海马齿状回。以前的研究^33-35报道下滑在某些情况下，癫痫海马神经发生，如慢性颞叶癫痫和学习赤字的关联，记忆障碍和自发的反复运动性发作。另外，还有在神经干细胞祖因素如FGF2和IGF-1中的动物模型³³长期痫海马的降低。考虑到这一点，介入策略，如星展，显示神经发生在齿状回的增强是令人兴奋的途径进行研究。这些发现促使我们进一步深入探索到底层机制的神经发生后DBS治疗癫痫。我们有针对性的ATN单方面双方（未报告数据），以及双边（有代表性的结果），看到高架神经营养因子（BDNF）的表达在大鼠海马齿状回。我们的C光凭目前的假设是，BDNF表达启动基因表达的级联高潮在神经发生该转换为DBS手术的抗癫痫作用。在本文中，我们提出我们的方法DBS手术针对ATN大鼠其次是基因表达分析作为一个有吸引力的方法来研究DBS的好处背后的机制。

Protocol

注：伦理学声明：本稿件讨论的所有程序都是按照NIH指南动物研究（指南护理和使用实验动物）和哈佛医学院IACUC委员会的批准。 1.预外科制备确保所有的手术器械是由任一高压灭菌或通过用消毒液和/或乙醇作为必要清洁消毒。如果可能的话，使用一次性无菌设备，如手术刀，针头和注射器。 覆盖手术单工作台，并确保有一个生物危险废物处置可供。 ?…

Representative Results

图1A和1B示出BDNF和GABRD相对于对照基因β肌动蛋白的相对表达。 BDNF，神经营养蛋白经常与在许多神经元疾病38-41神经保护作用相关联。因此，有趣的分析响应于它产生于癫痫患者的治疗益处的ATN刺激BDNF的表达谱。在图1A中示出了其中的BDNF横跨指示时间点的基因表达图谱发表的DBS刺激，BDNF上调立即（0小时）的DBS手术后第3小时观察到随着峰值表达式（3?…

Discussion

继Benabid 等具有里程碑意义的工作，用脑深部电刺激治疗帕金森氏病和特发性震颤，在DBS手术技术已经研究了很大的兴趣在过去十年来治疗许多神经系统疾病^6,10,43。针对大脑电路的各种神经解剖区域DBS的研究，许多团体正在执行，以解决主要的神经元​​疾病是临床试验的各个阶段。底丘脑核（STN）或苍白球（GPI）的内段的刺激被FDA批准并用于治疗运动障碍在帕金森氏病^…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500