Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

La estimulación cerebral profunda (DBS), la cirugía, apuntando a diferentes regiones del cerebro, como los ganglios basales, el tálamo y regiones subtalámico, es un tratamiento efectivo para varios trastornos del movimiento que no han respondido a la medicación. Los recientes progresos en el campo de la cirugía de DBS ha comenzado a extender la aplicación de esta técnica quirúrgica para otras condiciones tan diversas como la obesidad mórbida, la depresión y el trastorno obsesivo compulsivo. A pesar de estas indicaciones en expansión, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos subyacentes que facilitan los efectos beneficiosos de la cirugía de DBS. Un enfoque a esta pregunta es para llevar a cabo análisis de expresión génica en las neuronas que reciben la estimulación eléctrica. Estudios anteriores han demostrado que la neurogénesis en el giro dentado de la rata se provoca en DBS focalización del núcleo anterior del tálamo ^1. Cirugía de DBS focalización del ATN se utiliza ampliamente para el tratamiento de la epilepsia refractaria. Por tanto, es de mucho interest para nosotros para explorar los cambios transcripcional inducidos por la estimulación eléctrica de la ATN. En este manuscrito, describimos nuestras metodologías para estereotáctica guiada por cirugía de DBS focalización del ATN en ratas Wistar macho adultas. También se discuten los pasos subsiguientes para la disección de tejidos, el aislamiento de ARN, la preparación de ADNc y RT-PCR cuantitativa para medir los cambios de expresión génica. Este método podría aplicarse y modificarse para estimular los ganglios basales y en otras regiones del cerebro comúnmente clínicamente dirigida. El estudio de la expresión génica se describe aquí asume un enfoque objetivo de genes candidato para descubrir jugadores moleculares que podrían dirigir el mecanismo para DBS.

Introduction

La historia detrás del desarrollo de la estimulación cerebral profunda como técnica neuroquirúrgica se remonta a la década de 1870 cuando la posibilidad de la estimulación eléctrica de los circuitos cerebrales se exploró ^2. El uso de estimulación de alta frecuencia crónica como tratamiento para trastornos neuronales se inició en la década de 1960 ^3. Más tarde, en la década de 1990 con el advenimiento de la implantación crónica de DBS electrodos ^4-6, el número de trastornos neuronales que fueron tratados por DBS siguió aumentando. La estimulación cerebral profunda se utilizó por primera vez en los Estados Unidos como un tratamiento para el temblor esencial ^6. Hoy en día la cirugía se utiliza ampliamente para el tratamiento de trastornos neuronales que están actualmente intratables por la intervención farmacológica. DBS se utiliza actualmente para tratar los trastornos del movimiento de la enfermedad de Parkinson y la distonía ^7-9. Demencia de tipo Alzheimer, la enfermedad, la epilepsia, el dolor y enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión de Huntington, OCD, Tourette7; síndrome de adicción y s son algunas de las condiciones susceptibles de tratamiento por DBS ^10-12. Si bien la cirugía DBS está aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, distonía y el temblor esencial, el uso de DBS para tratar otras condiciones mencionadas anteriormente están en diversas etapas de laboratorio y los estudios clínicos que ofrecen una gran promesa a los pacientes ^13,14.

Clínicamente, la cirugía de DBS se realiza en dos etapas. La primera etapa consiste en la colocación de los electrodos quirúrgicamente DBS en la ubicación anatómica objetivo utilizando una combinación de posicionamiento radiológica, CT, MRI, así como lecturas de microelectrodos para mejorar la precisión. La segunda etapa consiste en la implantación de un generador de impulsos en la parte superior del pecho del paciente y la extensión de instalar conduce desde el cuero cabelludo para el generador de impulsos. Sobre la base de la condición neurológica, los esquemas de programación varios para el generador de impulsos se han estandarizado y se pueden usar para suministrar la tensión deseada. El volumen final deTage se alcanza de una manera gradual a fin de recibir la mejor respuesta clínica con un mínimo de voltaje ^15. Sin embargo, en nuestros estudios, a diferencia de los implantes crónicas DBS utilizado clínicamente, en aras de la simplicidad, hemos recurrido a estudiar una estimulación de alta frecuencia de una sola vez (durante 1 hora) en nuestros modelos animales.

Parte de la investigación de nuestro grupo se centra en investigar el uso de la cirugía de DBS para la epilepsia refractaria al tratamiento. Abordajes quirúrgicos estereotácticos utilizando la estimulación de alta frecuencia ha sido explorado por muchos otros como una opción eficaz para tratar la epilepsia médicamente refractaria que constituye alrededor del 30% de todas las incidencias de la epilepsia ^10,16,17. Estimulación cerebelosa la orientación de la superficie cortical, así como los núcleos cerebelares profundos se han utilizado en el pasado como dianas para tratar la epilepsia ^10,18,19. Además, la estimulación del hipocampo también se ha intentado, pero con resultados mixtos ^20,21. Algunos de los otros investigaronObjetivos de DBS para epilepsia incluyen la corteza cerebral, el tálamo, núcleo subtalámico y el nervio vago ^8. Sin embargo, a raíz de los resultados de varios estudios en los últimos años, el núcleo talámico anterior (ATN) se ha convertido en el objetivo DBS más común para el tratamiento de la epilepsia ^10,22. Sobre la base de conocimiento acerca de los circuitos neuroanatómicos y los resultados de los modelos animales, varios estudios se han centrado en el efecto terapéutico de la estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia ^23-26. El ATN es parte del circuito límbico y se encuentra en la región del cerebro que afecta a la frecuencia de convulsiones. Los estudios realizados por Hamani et al., Han puesto a prueba la eficacia de ATN-DBS en un modelo de epilepsia inducida por pilocarpina y encontró que la estimulación bilateral ATN latencias para las convulsiones inducidas por pilocarpina y el estado epiléptico ²⁴ prolonga. Por otra parte, se encontró la estimulación de alta frecuencia de la ATN para reducir la frecuencia de convulsiones en un modelo pentilentetrazol (PTZ) de epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Han informado de una reducción media en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 75% a la crónica estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia parcial refractaria ^30.

Un estudio clínico reciente sobre la epilepsia refractaria al tratamiento ha mostrado resultados prometedores después de la cirugía de DBS dirigidas al núcleo talámico anterior (ATN) ^22. Un ensayo clínico aleatorio multicéntrico con 110 pacientes sometidos a estimulación cerebral profunda bilateral del ATN para el tratamiento de la epilepsia refractaria (ensayo SANTE) indica una caída en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 40% ^31. Los resultados de este estudio también dio a entender en un efecto antiepiléptico óptima retraso observado a los 2-3 meses después de la cirugía. Posteriores estudios de Toda et al., Corroboradas con estos hallazgos en la que demostraron neurogénesis ocurre en un puesto de tiempo después de DBS (días 3-5) en modelos animales ^1. Además, Encinas et al., Han informado neurógena del hipocamposis en el ratón adulto giro dentado después de la estimulación de alta frecuencia de la ATN ^32. Estudios previos han informado de la disminución de ^{33 a 35} neurogénesis del hipocampo, en algunos casos de epilepsia como la epilepsia del lóbulo temporal, crónica y una asociación con déficit de aprendizaje, trastornos de la memoria y espontáneos recurrentes crisis motoras. Además, hubo una reducción de los factores de células madre progenitoras neurales tales como FGF2 y IGF-1 en el hipocampo crónicamente epiléptico en modelos animales ^33. Teniendo en cuenta esto, las estrategias intervencionistas como la DBS que muestran un aumento de la neurogénesis en el giro dentado son vías interesantes para la investigación. Estos resultados nos han animado a explorar más profundamente en el mecanismo subyacente tratamiento neurogénesis post-DBS para la epilepsia. Hemos apuntado a la ATN tanto unilaterales (datos no informados), así como de forma bilateral (en los resultados representativos) y visto neurotrofina elevada (BDNF) expresión en el giro dentado de ratas. Nuestra chipótesis urrent es que la expresión de BDNF inicia una cascada de expresión génica que culmina en la neurogénesis que se traduce en el efecto antiepiléptico de la cirugía de DBS. En este trabajo, presentamos nuestros métodos para la cirugía de DBS focalización del ATN en ratas, seguido de análisis de expresión génica como un enfoque atractivo para estudiar el mecanismo que subyace a los beneficios de la DBS.

Protocol

Declaración de Ética: NOTA: Todos los procedimientos discutidos en este manuscrito son de acuerdo con las directrices del NIH para la Investigación Animal (Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) y son aprobados por el Comité CICUAL Escuela de Medicina de Harvard. Preparación 1. Pre-quirúrgico Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante autoclave o bien mediante la limpieza con solución y / o etanol antiséptico según sea n…

Representative Results

Figuras 1A y 1B muestran la expresión relativa de BDNF y GABRD en relación con el gen de control de β-actina. BDNF, una neurotrofina se asocia a menudo con efectos neuroprotectores en muchas enfermedades neuronales 38-41. Por tanto, es interesante analizar el perfil de expresión de BDNF en respuesta a la estimulación de la ATN que produce beneficios terapéuticos a pacientes epilépticos. En la Figura 1A que muestra el perfil de expresión génica de BDN…

Discussion

Siguiendo el trabajo de la señal por Benabid et al., En el uso de la estimulación cerebral profunda para tratar la enfermedad de Parkinson y temblor esencial, la técnica quirúrgica DBS ha sido investigado con mucho interés en la última década para tratar muchos trastornos neurológicos ^6,10,43. Estudios DBS dirigidas a las distintas regiones neuro-anatómico de los circuitos cerebrales se realizan actualmente por muchos grupos para hacer frente a las principales enfermedades neuronales y se en…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500