Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie, gericht op diverse gebieden van de hersenen, zoals de basale ganglia, thalamus, en subthalamische regio's, is een effectieve behandeling voor verschillende bewegingsstoornissen die niet hebben gereageerd op medicatie. Recente vooruitgang op het gebied van DBS chirurgie is begonnen met de toepassing van deze chirurgische techniek andere condities zo divers als morbide obesitas, depressie en obsessieve compulsieve stoornis verlengen. Ondanks deze uitbreiding van indicaties, is er weinig bekend over de onderliggende fysiologische mechanismen die de gunstige effecten van DBS operatie te vergemakkelijken. Een manier om deze vraag genexpressie analyse op neuronen die de elektrische stimulatie ontvangt. Eerdere studies hebben aangetoond dat neurogenese in de dentate gyrus rat wordt opgewekt in DBS richten van de voorste nucleus van de thalamus ^1. DBS operatie gericht op de ATN wijd gebruikt voor behandeling van epilepsie. Het is derhalve van veel interest voor ons om de transcriptionele veranderingen bij elektrisch stimuleren van de ATN verkennen. In dit manuscript, beschrijven we onze methoden voor stereotactische-begeleide DBS operatie gericht op de ATN bij volwassen mannelijke Wistarratten. We bespreken ook de volgende stappen voor weefseldissectie, RNA isolatie, cDNA bereiding en kwantitatieve RT-PCR voor het meten van genexpressie verandert. Deze methode kan worden toegepast en aangepast voor het stimuleren van de basale ganglia en andere gebieden van de hersenen vaak klinisch gericht. De genexpressie studie die hier beschreven wordt uitgegaan van een kandidaat-target-gen benadering voor het ontdekken van de moleculaire spelers die kunnen worden regisseren het mechanisme voor DBS.

Introduction

De geschiedenis achter de ontwikkeling van Deep Brain Stimulation als een neurochirurgische techniek dateert uit de jaren 1870, wanneer de mogelijkheid van het elektrisch stimuleren van de hersenen circuits werd verkend ^2. Het gebruik van chronische hoogfrequente stimulatie als behandeling van neuronale aandoeningen begon in 1960 ^3. Later in de jaren 1990 met de komst van chronische implantatie DBS elektroden ^4-6, het aantal neuronale aandoeningen die werden behandeld met DBS blijven stijgen. DBS werd eerst gebruikt in de Verenigde Staten voor de behandeling van essentiële tremor ^6. Vandaag de operatie wordt veel gebruikt om neuronale stoornissen die momenteel onbehandelbaar farmacologisch ingrijpen behandelen. DBS wordt momenteel gebruikt voor bewegingsstoornissen van Parkinson en dystonie ^7-9 behandelen. Type Alzheimer dementie, de ziekte van Huntington, epilepsie, pijn en neuropsychiatrische aandoeningen depressie, OCD, syndroom7, syndroom en verslaving aantal van de voorwaarden vatbaar voor behandeling door DBS ^10-12. Terwijl DBS chirurgie FDA goedgekeurd voor behandeling van ziekten, dystonie en essentiële tremor Parkinson, het gebruik van DBS voor de behandeling van overige bovengenoemde voorwaarden in verschillende stadia van laboratorium en klinische studies met veelbelovend patiënten ^13,14.

Klinisch wordt DBS operatie uitgevoerd in twee fasen. De eerste fase operatief plaatsen van de DBS elektroden de gerichte anatomische locatie met behulp van een combinatie van radiologische positioneren, CT, MRI en micro-elektrode metingen voor verbeterde nauwkeurigheid. De tweede stap omvat het implanteren van een pulsgenerator borst van de patiënt en het installeren verlengkabels van de hoofdhuid op de pulsgenerator. Op basis van de neurologische aandoening, hebben verscheidene regelingen programmering van de pulsgenerator gestandaardiseerd en wordt gebruikt om de gewenste spanning te leveren. De finale voltage bereikt stapsgewijs om de beste klinische respons met minimale spanning ¹⁵ ontvangen. In onze studies, in tegenstelling tot chronische DBS implantaten klinisch toegepast omwille van de eenvoud hebben we toevlucht te bestuderen eenmalig hoogfrequente stimulatie (1 uur) in onze diermodellen.

Een deel van het onderzoek van onze groep richt zich op onderzoek naar het gebruik van DBS chirurgie voor de behandeling-refractaire epilepsie. Stereotactische chirurgische benadering en de hoogfrequente stimulatie werd onderzocht door velen als een effectieve mogelijkheid om medisch refractaire epilepsie ongeveer 30% van alle gevallen van epilepsie ^10,16,17 vormt behandelen. Cerebellaire corticale stimulatie gericht op het oppervlak als de diepe kernen werden in het verleden gebruikt als doelwit om epilepsie te behandelen ^10,18,19. Daarnaast heeft hippocampus stimulatie ook geprobeerd maar met gemengde resultaten ^20,21. Enkele van de andere onderzochteDBS targets voor epilepsie zijn de cerebrale cortex, thalamus, subthalamische kern en nervus vagus ^8. Echter, na de resultaten van verschillende studies in de afgelopen jaren, de anterieure thalamus nucleus (ATN) heeft ontpopt als de meest voorkomende DBS doelwit voor de behandeling van epilepsie ^10,22. Gebaseerd op kennis neuroanatomical circuits en bevindingen uit diermodellen, hebben verschillende studies gericht op het therapeutisch effect van diepe hersenstimulatie van de ATN bij de behandeling van epilepsie ^23-26. Het ATN is onderdeel van het limbische circuit en ligt in het gebied van de hersenen dat aanvalsfrequentie beïnvloedt. Studies door Hamani et al., Hebben de werkzaamheid van ATN-DBS in een pilocarpine-geïnduceerde epilepsie model getest en dat bilaterale ATN stimulatie verlengd latencies voor pilocarpine-geïnduceerde aanvallen en status epilepticus ^24. Bovendien hoogfrequente stimulatie van de ATN bleek de frequentie van aanvallen te verminderen in een pentyleentetrazol (PTZ) model van de epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Hebben gemeld een gemiddelde verlaging van de frequentie van aanvallen met ongeveer 75% bij chronische diepe hersenstimulatie van de ATN in de behandeling van refractaire partiële epilepsie ^30.

Een recente klinische studie over de behandeling-refractaire epilepsie heeft veelbelovende resultaten na DBS operatie gericht op de anterieure thalamus nucleus (ATN) ^22. Een multicenter gerandomiseerde klinische studie met 110 patiënten die een bilaterale DBS van de ATN voor behandeling refractaire epilepsie (SANTE trial) wees op een daling van de frequentie van aanvallen met ongeveer 40% ^31. De resultaten van deze studie ook doorschemeren op een vertraagde optimale anti-epileptisch effect waargenomen bij 2-3 maanden na de operatie. Verdere studies van Toda et al., Bevestigd deze bevindingen waar zij aangetoond neurogenese er op een later tijdstip na DBS (dagen 3-5) in diermodellen ^1. Bovendien Encinas et al. Hebben gemeld hippocampale neurogenesis in de volwassen muis gyrus dentatus na hoogfrequente stimulatie van de ATN ^32. Eerdere studies ^33-35 hebben gemeld dalende hippocampus neurogenese in bepaalde epileptische gevallen zoals chronische temporale kwab epilepsie en een associatie met tekorten leren, geheugenstoornissen en spontane terugkerende motorische aanvallen. Bovendien was er een vermindering van neurale stamcellen progenitor factoren zoals FGF2 en IGF-1 in het chronisch epileptische hippocampus in diermodellen ^33. Gezien dit, interventiestrategieën zoals DBS dat een vergroting van neurogenese in de dentate gyrus zien zijn spannende mogelijkheden voor onderzoek. Deze bevindingen hebben ons aangemoedigd om verder te diepen in het mechanisme onderliggende neurogenese post-DBS behandeling voor epilepsie. We hebben de ATN gericht zowel eenzijdig (gegevens niet gemeld) als bilateraal (in representatieve resultaten) en gezien verhoogde neurotrophin (BDNF) expressie in de rat dentate gyrus. Onze cUIDIGE hypothese is dat BDNF expressie initieert een cascade genexpressie die culmineert in neurogenese dat vertaalt naar het anti-epileptisch effect DBS chirurgie. In dit artikel presenteren we onze werkwijzen voor DBS operatie gericht op de ATN ratten gevolgd door analyse van genexpressie als een aantrekkelijke benadering voor het mechanisme achter de voordelen van DBS bestuderen.

Protocol

OPMERKING: Ethiek Verklaring: Alle procedures besproken in dit handschrift zijn in overeenstemming met de NIH richtlijnen voor Animal Research (Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren) en zijn goedgekeurd door de Harvard Medical School IACUC commissie. 1. Pre-operatieve voorbereiding Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd door ofwel een autoclaaf of door het reinigen met een antiseptische oplossing en / of ethanol als dat nodig is. Waar mogel…

Representative Results

Figuren 1A en 1B tonen de relatieve expressie van BDNF en GABRD opzichte van de controle gen β-actine. BDNF is een neurotrofine vaak geassocieerd met neuroprotectieve effecten in veel neuronale ziekten 38-41. Het is daarom interessant om het expressieprofiel van BDNF te analyseren in respons op stimulatie van de ATN die therapeutische voordelen epileptische patiënt oplevert. In figuur 1A waarin het genexpressieprofiel van BDNF in de aangegeven tijdstippen t…

Discussion

Na het oriëntatiepuntwerk door Benabid et al. Het gebruik diepe hersenstimulatie voor het behandelen Parkinson en essentiële tremor, heeft de DBS operatietechniek onderzocht met veel belangstelling de afgelopen tien jaar veel neurologische aandoeningen ^6,10,43 behandelen. DBS studies gericht op diverse neuro-anatomische gebieden van de hersenen circuits worden momenteel uitgevoerd door vele groepen tot grote neuronale ziekten aan te pakken en zich in verschillende stadia van klinische proeven. Stim…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500