ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

גירוי מוחי עמוק ניתוח (DBS), מיקוד לאזורים שונים של המוח כגון גרעיני הבסיס, תלמוס, ואזורי subthalamic, הוא טיפול יעיל לכמה הפרעות תנועה שלא הגיבו לטיפול תרופתי. ההתקדמות האחרונה בתחום של ניתוחי DBS החלה להרחיב את היישום של טכניקה ניתוחית זו למצבים אחרים מגוונים כמו השמנת יתר חולנית, דיכאון והפרעת אובססיבית כפייתית. למרות סימני הרחבת אלה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים הפיסיולוגיים הבסיסיים המאפשרים את ההשפעות המיטיבות של ניתוח DBS. גישה אחת לשאלה זו היא לבצע ניתוח ביטוי גנים בתאי עצב המקבלים גירוי החשמלי. מחקרים קודמים הראו כי neurogenesis ברכס המשונן חולדה שהושרו בDBS מיקוד של הגרעין הקדמי של התלמוס ^1. ניתוח DBS מיקוד ATN נמצא בשימוש נרחב לטיפול באפילפסיה עקשן. מתבררים שהוא בעל הרבה interest לנו לחקור את שינויי תעתיק הנגרמים על ידי גירוי חשמלי ATN. בכתב היד הזה, אנו מתארים שיטות שלנו לניתוח DBS stereotactically מודרך מיקוד ATN בחולדות Wistar זכר בוגרים. כמו כן נדונונו בשלבים הבאים לנתיחה רקמה, בידוד RNA, הכנת cDNA וRT-PCR למדידת שינויי ביטוי גנים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת ושונה לגירוי הגרעינים הבזליים ואזורים אחרים של המוח בדרך כלל ממוקדים מבחינה קלינית. מחקר ביטוי גנים המתוארים כאן מניח גישת גן מטרת מועמד לגילוי שחקנים מולקולריים שיכול לנתב את המנגנון לDBS.

Introduction

ההיסטוריה מאחורי הפיתוח של Deep Brain Stimulation כטכניקה הנוירוכירורגית שתחילתה 1870 כאשר האפשרות של גירוי חשמלי החשמלי במוח שנחקרה ^2. השימוש בגירוי בתדר גבוה כרוני כטיפול בהפרעות עצביות התחיל ב -1960 ^3. מאוחר יותר בשנת 1990 עם כניסתו של אלקטרודות DBS השתלה כרונית ^4-6, מספר ההפרעות עצביות שטופלו על ידי DBS המשיך לעלות. גירוי מוחי עמוק היה בשימוש לראשונה בארצות הברית לטיפול ברעד חיוני ^6. היום הניתוח נעשה שימוש נרחב לטיפול בהפרעות עצביות שנמצאות כרגע חשוכים על ידי התערבות תרופתית. DBS משמש כיום לטיפול בהפרעות תנועה של המחלה ודיסטוניה ^7-9 פרקינסון. דמנציה אלצהיימר הסוג, הדיכאון כגון מחלה, אפילפסיה, הכאב ומחלות נוירו-פסיכיאטריות של הנטינגטון, OCD, תסמונת טורט7; s תסמונת והתמכרות הן חלק מהתנאים נוחים לטיפול על ידי DBS ^10-12. בזמן ניתוח DBS מאושר FDA לטיפול במחלת פרקינסון, דיסטוניה ורעד חיוני, השימוש בDBS לטיפול במצבים אחרים שהוזכרו לעיל נמצא בשלבים שונים של מעבדה ומחקרים קליניים המציעים הרבה הבטחה לחולי ^13,14.

מבחינה קלינית, ניתוח DBS מתבצע בשני שלבים. בשלב הראשון מדוברים בניתוח מיצוב אלקטרודות DBS במיקום האנטומי ממוקד באמצעות שילוב של מיקום רדיולוגי, CT, MRI, כמו גם קריאות microelectrode לדיוק משופר. השלב השני כרוך בהשתלת מחולל פעימות בחזה העליון של המטופל והארכת התקנה מובילה מהקרקפת למחולל הפעימות. בהתבסס על מצב הנוירולוגים, מספר תוכניות תכנות למחולל הפעימות כבר טופל ותשמש כדי לספק את המתח הרצוי. כרך האחרוןכאחוז הוא הגיע באופן הדרגתי, כדי לקבל את התגובה הקלינית הטובה ביותר עם ​​מתח מינימאלי ^15. עם זאת, במחקרים שלנו, בניגוד לשתלי DBS הכרוני בשימוש קליני, לשם פשטות, יש לנו פנו ללימודי גירוי חד פעמי בתדירות גבוהה (עבור שעה 1) במודלים של בעלי החיים שלנו.

חלק מהמחקר של הקבוצה שלנו מתמקד בחקירת השימוש בניתוחי DBS לאפילפסיה טיפול עקשן. גישות כירורגיות stereotactic באמצעות גירוי בתדר גבוה נחקרו על ידי רבים אחרים כאופציה יעילה לטיפול באפילפסיה רפואית-עקשן המהווה כ -30% מכל מקרים של אפילפסיה ^10,16,17. גירוי המוח הקטן מיקוד משטח קליפת המוח, כמו גם את גרעיני המוח הקטן העמוקים שימש בעבר כמטרות לטיפול באפילפסיה ^10,18,19. בנוסף, גירוי היפוקמפוס יש גם ניסה אבל עם תוצאות מעורבות ^20,21. חלק מהאחר נחקרמטרות DBS לאפילפסיה כוללות קליפת המוח, התלמוס, גרעין subthalamic ועצב התועה ^8. עם זאת, תוצאות ממספר מחקרים בשנים האחרונות הבאות, הגרעין הקדמי התלמוס (ATN) התפתחה כיעד DBS הנפוץ ביותר לטיפול באפילפסיה ^10,22. בהתבסס על ידיעה על מעגלים וממצאים ממודלים של בעלי החיים neuroanatomical, כמה מחקרים התמקדו בהשפעה הטיפולית של גירוי מוחי העמוק של ATN בטיפול באפילפסיה ^23-26. ATN הוא חלק מהמעגל הלימבית, והוא ממוקם באזור במוח שמשפיע על תדירות התקפים. מחקרים על ידי Hamani et al., בדקו את היעילות של ATN-DBS במודל אפילפסיה pilocarpine מושרה ומצאו שגירוי ATN דו-צדדי ממושך latencies להתקפים הנגרם pilocarpine וסטטוס אפילפטיקוס ^24. יתר על כן, גירוי בתדר גבוה של ATN נמצא כדי להפחית את תדירות התקפים במודל pentylenetetrazol (PTZ) של epilepsy ^25,27-29. Lee et al., דיווח ירידה ממוצעת בתדירות התקפים בכ -75% על גירוי מוחי עמוק כרוני של ATN בטיפול באפילפסיה חלקית עקשן ^30.

מחקר קליני אחרונים על אפילפסיה טיפול עקשן הראה תוצאות מבטיחות לאחר ניתוח DBS מיקוד הגרעין הקדמי התלמוס (ATN) ^22. ניסוי קליני רב-מרכזי אקראי עם 110 חולים שעברו DBS הדו-צדדי של ATN לאפילפסיה עקשן הטיפול (משפט סנטה) הצביע על ירידה בתדירות התקפים בכ -40% ^31. התוצאות ממחקר זה גם רמזו על השפעה אנטי-אפילפטי אופטימלי מתעכבת נצפתה בניתוח שלאחר 2-3 חודשים. מחקרים נוספים על ידי אל Toda et., אימתו עם ממצאים אלה שבו הם הפגינו neurogenesis קורים בפוסט מאוחר יותר זמן DBS (ימים 3-5) במודלים של בעלי חיים ^1. בנוסף, Encinas et al., דיווח neurogene בהיפוקמפוסsis ברכס המשונן העכבר המבוגר לאחר גירוי בתדר גבוה של ATN ^32. מחקרים קודמים ^33-35 דיווחו ירידת neurogenesis בהיפוקמפוס במקרי אפילפסיה מסוימות כגון אפילפסיה כרונית זמנית אונה ושיתוף עם גירעונות למידה, פגיעה בזיכרון והתקפים חוזרים ונשנים מנוע ספונטניים. כמו כן, חלה ירידה בגורמי מוליד תאי גזע עצביים כגון FGF2 וIGF-1 בהיפוקמפוס כרוני אפילפסיה במודלים של בעלי החיים ^33. בהתחשב בעובדה זו, אסטרטגיות התערבותית כגון DBS שמראות הגדלת הנוירוגנזה ברכס המשונן הם אפיקים מרגשים למחקר. ממצאים אלו עודדו אותנו להמשיך ולחקור לעומק את טיפול neurogenesis פוסט-DBS הבסיסי מנגנון לאפילפסיה. יש לנו ממוקד ATN שני באופן חד צדדי (נתונים לא פורסמו), כמו גם דו-צדדי (בתוצאות נציג) וביטוי ראה neurotrophin מוגבה (BDNF) ברכס המשונן חולדה. גההשערה היא שurrent ביטוי BDNF יוזם מפל ביטוי גנים שמגיע לשיאו בneurogenesis שמתרגם להשפעה אנטי-אפילפטי של ניתוח DBS. במאמר זה, אנו מציגים את השיטות שלנו לניתוח DBS מיקוד ATN בחולדות ואחרי ניתוח ביטוי גנים כגישה אטרקטיבית ללמוד את המנגנון שבבסיס היתרונות של DBS.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה כל הנהלים דנו בכתב היד הזה הם בהתאם להנחיות NIH למחקר בבעלי חיים (מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה) ואושרה על ידי ועדת IACUC בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד. הכנת 1. טרום ניתוחית <li style=";text-…

Representative Results

האיורים 1 א ו -1 B להראות הביטוי היחסי של BDNF וGABRD ביחס לβ-אקטין גן השליטה. BDNF, neurotrophin קשור לעתים קרובות עם אפקטי neuroprotective במחלות עצביות רבות 38-41. זה מעניין, ולכן לנתח את פרופיל הביטוי של BDNF בתגובה לגירוי של ATN אשר מניב יתרונות טיפוליים לחולי אפילפסי?…

Discussion

בעקבות העבודה על ידי ציון דרך אל Benabid et. בבאמצעות גירוי מוחי עמוק לטיפול במחלות ורעד חיוני פרקינסון, הטכניקה הניתוחית DBS נחקרה בעניין רב בעשור האחרון לטיפול בהפרעות נוירולוגיות רבות ^6,10,43. מחקרי DBS מיקוד אזורי נוירו-אנטומיים שונים של המערכת החשמלית במוח…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500