전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

깊은 뇌 자극 (DBS) 수술 등 기저핵, 시상 및 시상 영역으로 뇌의 다양한 지역을 대상으로, 약물 치료에 반응하지 못한 여러 가지 운동 장애에 대한 효과적인 치료입니다. DBS 수술 분야의 최근 발전은 비만, 우울증과 강박 장애 등 다양한 다른 조건이 수술 기법의 응용 프로그램을 확장하기 시작했다. 이러한 확대 표시에도 불구하고, 거의 DBS 수술의 유익한 효과를 촉진 기본 생리 학적 메커니즘에 대한 알려져있다. 이 질문에 대한 하나의 접근은 전기 자극을 수신 뉴런 유전자 발현 분석을 수행하는 것이다. 이전의 연구는 쥐의 치아 이랑에서 그 신경은 시상 ^(1)의 전방 핵의 대상 DBS에 유도되어 보여 주었다. ATN을 대상으로 DBS 수술은 치료 불응 성 간질을 위해 널리 사용됩니다. 따라서 그것은 많은 가출 중 하나입니다우리 t 전기적으로 ATN을 자극에 의​​해 유도되는 전사 변화를 탐구한다. 이 논문에서 우리는 성인 남성의 Wistar 쥐에서 ATN을 대상으로 정위 유도 DBS 수술에 대한 우리의 방법을 설명합니다. 우리는 또한 유전자 발현 변화를 측정하기위한 조직 박리, RNA 분리, cDNA를 준비하고 정량적 RT-PCR을위한 다음 단계에 대해 설명합니다. 이 방법은 적용 일반적으로 임상 적 대상 기저핵과 뇌의 다른 영역을 자극 수정할 수 있습니다. 여기에 설명 된 유전자 발현 연구는 DBS위한 메커니즘을 지시 할 수있는 분자 플레이어를 발견하기위한 후보 타겟 유전자 접근법을 가정한다.

Introduction

전기적으로 뇌 회로를 자극 할 가능성이 ² 탐험 때 신경 외과 기술로 뇌 심부 자극의 발전 뒤에 역사는 1870 년대로 거슬러 올라간다. 신경 장애의 치료 만성 고주파 자극의 사용은 1960 년에 시작 ^3. 나중에 만성 이식 DBS 전극 ^4-6의 출현으로 1990 년, DBS로 처리 하였다 신경 질환의 수는 계속 증가. 뇌 심부 자극 태성 진전 제 ⁶ 치료제로 미국에서 사용 하였다. 오늘 수술은 현재 약물의 개입에 의해 치료할 수있는 신경 질환을 치료하는 데 널리 사용된다. DBS는 현재 파킨슨 병 및 근긴장 ^7-9의 운동 장애를 치료하는 데 사용된다. 알츠하이머 형 치매, 헌팅 톤병, 간질, 통증 및 신경 정신 질환 우울증, 강박 장애, 뚜렛7; 증후군 및 중독 DBS ^10-12로 처리 의무 조건의 일부입니다. DBS 수술 FDA는 파킨슨 병, 및 근육 긴장 태성 진전을 치료하기위한 승인을하는 동안, 상기 언급 된 기타 상태의 치료를위한 DBS의 사용은 환자 ^{(13, 14)에} 많은 가능성을 제공하는 랩의 다양한 단계 및 임상 연구이다.

임상 적으로, DBS 수술은 두 단계로 수행된다. 첫 번째 단계는 방사선 수술 위치의 조합을 이용하여 해부학 적 위치에 타겟 DBS 전극을 위치시키는 것을 포함한다, CT, MRI뿐만 아니라 향상된 정밀도를 미세 판독. 두 번째 단계는 환자의 가슴 윗부분에 펄스 발생기를 주입하는 것을 포함하고 연장 설치는 펄스 발생기에 두피로부터 리드. 신경 학적 조건에 기초하여, 펄스 발생기의 프로그래밍을위한 여러 방식이 규격화되어​​ 있고 원하는 전압을 제공하기 위해 사용될 것이다. 최종 권최소 전압 ¹⁵ 가장 임상 적 응답을 수신하도록 다케는 단계적으로 진행한다. 그러나, 우리의 연구에서 만성 DBS 임플란트 달리 간략화를 위해 임상 적으로 사용 된, 우리는 동물 모델에서 (1 시간 동안) 한번 고주파 자극을 연구에 의존했다.

우리의 연구 그룹의 일부는 치료 – 간질 DBS 수술의 사용을 연구에 초점을 맞추고있다. 고주파 자극을 사용하여 정위 수술 방법은 간질 ^10,16,17의 모든 발생률의 약 30 %를 구성하는 의학적 내화물 간질을 치료하는 효과적인 옵션으로 많은 다른 사람에 의해 탐구하고있다. 깊은 소뇌 핵뿐 아니라 피질 표면 타겟팅 소뇌 자극 ^{10,18,19 간질을} 치료 표적으로 이전에 사용되어왔다. 또한, 해마 자극도 시도했지만 혼합 된 결과 ^{(20, 21)와} 함께하고있다. 다른 일부 조사간질에 대한 DBS 목표는 대뇌 피질, 시상, 시상 핵과 미주 신경 ^(8)를 포함한다. 그러나 지난 몇 년 동안 여러 연구에서 다음과 같은 결과는, 전방 시상 핵 (ATN)은 간질 치료 ^10,22에 대한 가장 일반적인 DBS 대상으로 떠오르고있다. 신경 해부학 회로, 및 동물 모델로부터의 결과에 대한 지식에 기초하여, 여러 연구 ^23-26 간질 ^치료에 ATN의 깊은 뇌 자극 치료 효과에 초점을 맞추었다. ATN은 변연계 회로의 일부이며 발작 빈도에 영향을 미치는 뇌의 영역에 위치하고 있습니다. 로 Hamani 등. 연구, 필로 카르 핀에 의한 간질 모델에서 ATN-DBS의 효능을 시험하고 양국 간 ATN 자극이 필로 카핀에 의한 발작과 간질 중첩증 ^(24)에 대한 대기 시간을 연장 것을 발견했다. 또한, ATN의 고주파 자극의 EP pentylenetetrazol (PTZ) 모델에서 발작 빈도수를 감소였다^25,27-29 ilepsy. Lee 등 알., 내화물 부분 간질 ^{(30)의 치료에} ATN의 만성 깊은 뇌 자극에 따라 약 75 %의 발작 빈도의 평균 감소를보고했다.

치료 불응 성 간질에 대한 최근의 임상 연구는 전방 시상 핵 (ATN) ²² 대상 DBS 수술 후 유망한 결과를 보여 주었다. 치료 불응 성 간질 (SANTE 시험)에 대한 ATN의 양자 DBS를받은 110 명의 환자와 다기관 무작위 임상 시험은 약 40 % ^(31)에 의해 발작 빈도의 저하를 지적했다. 본 연구의 결과는 또한 2~3개월 포스트 수술에서 관찰 지연 최적 항 간질 효과를 시사. 토다 등의 등으로 추가적인 연구., 그들은 동물 모델 ¹ 나중에 포스트 DBS (일 3-5)에서 일어나는 신경을 보여 곳 이러한 연구 결과로 뒷받침. 또한, Encinas 등., 해마 neurogene 신고되었습니다ATN ^(32)의 고주파 자극 후 성인 마우스 치아 이랑의 동생. 이전의 연구 ^33-35은 만성 측두엽 간질과 학습 적자와 관련, 기억 손상과 자연 재발 모터 발작 같은 특정 간질의 경우 해마의 신경 발생을 감소 신고되었습니다. 또한, 이러한 동물 모델 ⁽³³⁾ 만성 간질 해마 FGF2 및 IGF-1과 신경 줄기 세포 전구 세포 인자의 감소가 있었다. 이 고려, 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 신경의 증가를 보여 같은 DBS 등의 중재 전략 연구를위한 흥미로운 길이다. 이러한 연구 결과는 간질의 메커니즘 기본 신경 포스트 DBS 치료에 더 깊이 탐구하는 우리를 격려했다. 우리는 (대표 결과에) (데이터가보고되지 않음)뿐만 아니라 양측 모두 일방적으로 ATN을 목표로하고 쥐의 치아 이랑에서 볼 수 증가 뉴로 트로 (BDNF) 표현했다. 우리의 Current 가설은 BDNF 발현 DBS 수술의 항 간질 효과로 해석 신경 절정 유전자 발현 캐스케이드를 개시하는 것이다. 이 논문에서는 DBS의 장점을 기본 메커니즘을 연구하는 매력적인 방법으로 유전자 발현 분석 한 다음 쥐의 ATN을 대상으로 DBS 수술에 대한 우리의 방법을 제시한다.

Protocol

참고 : 윤리 문 :이 원고에서 설명하는 모든 절차는 (실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드) 동물 연구에 대한 NIH의 지침에 따라이며, 하버드 의과 대학 IACUC위원회에 의해 승인됩니다. 1. 수술 전 준비 모든 수술 도구 중 하나를 고압 증기 멸균 또는 필요에 따라 소독액 및 / 또는 에탄올로 세정 소독되어 있는지 확인합니다. 가능하다면, 이러한 메스, 바늘과 주사?…

Representative Results

도 1a 및도 1b는 제어 유전자 β 액틴에 BDNF와 GABRD의 상대적 표현을 나타낸다. BDNF는, 뉴로 트로는 종종 많은 신경 질환의 38 ~ 41의 신경 보호 효과와 관련이있다. 이것은 간질 환자에게 치료 적 이점을 수득 ATN의 자극에 응답하여 BDNF의 발현 프로파일을 분석하는 것이 흥미 롭다. 표시된 시간 – 점 걸쳐 BDNF의 유전자 발현 프로파일을 도시도 1a에 DBS 자극을 게시, BDNF는…

Discussion

Benabid 등의 등으로 랜드 마크 작업에 따라. 파킨슨 병 및 태성 진전을 치료하는 뇌 심부 자극을 사용하여, DBS 수술 기법은 많은 신경 장애 ^6,10,43을 치료하기 위해 지난 10 년 동안 많은 관심을 가지고 연구되어왔다. 뇌 회로의 다양한 신경 해부학 지역을 대상으로 DBS 연구는 현재 주요 신경 질환을 해결하기 위해 많은 그룹에 의해 수행되는 임상 시험의 다양한 단계에있다. 시?…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500