Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Tiefen Hirnstimulation (DBS) Chirurgie, die auf die verschiedenen Regionen des Gehirns, wie der Basalganglien, Thalamus und subthalamicus Regionen ist eine wirksame Behandlung für verschiedene Bewegungsstörungen, die ausgefallen sind, um Medikamente reagieren. Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der DBS Operation begonnen hat, die Anwendung dieser OP-Technik, um andere Bedingungen so vielfältig wie krankhafte Fettsucht, Depressionen und Zwangsstörungen zu erweitern. Trotz dieser Ausweitung Hinweise, ist nur wenig über die zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen, die wohltuende Wirkung des DBS Operation erleichtern bekannt. Ein Ansatz für diese Frage ist es, Genexpressionsanalyse in Neuronen, die elektrische Stimulation erhalten zuführen. Frühere Studien haben gezeigt, daß Neurogenese bei der Ratte Gyrus dentatus wird in DBS ausgelöst Targeting des anterioren Nucleus des Thalamus ^1. DBS Operation gezielt den ATN ist weithin für die Behandlung refraktärer Epilepsie eingesetzt. Es ist daher von sehr interest für uns, um die Transkriptionsänderungen durch elektrische Stimulation der ATN induzierte erkunden. In diesem Manuskript beschreiben wir unsere Methoden für die stereotaktisch geführte DBS Operation gezielt den ATN bei erwachsenen männlichen Wistar-Ratten. Wir haben auch die nachfolgenden Schritte für Gewebedissektion, RNA-Isolierung, cDNA-Präparation und quantitative RT-PCR diskutieren zur Messung der Genexpression ändert. Dieses Verfahren könnte angewandt und für die Stimulierung der Basalganglien und andere Regionen des Gehirns allgemein klinisch gezielt modifiziert werden. Die Genexpression Studie hier beschriebenen übernimmt einen Kandidaten Zielgen Ansatz für die Entdeckung der molekularen Spieler, die Regie führen konnte den Mechanismus für die DBS.

Introduction

Die Geschichte hinter der Entwicklung der Tiefenhirnstimulation als neurochirurgische Technik stammt aus den 1870er Jahren, wenn die Möglichkeit der elektrischen Stimulation des Gehirns Schaltungen wurde ² untersucht. Die Verwendung von chronischen Hochfrequenzstimulation zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen begann in den 1960er Jahren ^3. Später in den 1990er Jahren mit dem Aufkommen von chronischen Implantation DBS-Elektroden ^4-6, die Anzahl von neuronalen Störungen, die von DBS behandelt wurden weiter zu. Tiefe Hirnstimulation wurde zum ersten Mal in den USA zur Behandlung von essentiellem Tremor ⁶ verwendet. Heute ist die Operation wird häufig zur neuronalen Störungen, die derzeit nicht behandelbar durch pharmakologische Intervention, zu behandeln. DBS ist derzeit zur Behandlung von Bewegungsstörungen Parkinson-Krankheit und Dystonie ^7-9 behandeln. Alzheimer-Demenz, Huntington-Krankheit, Epilepsie, Schmerzen und neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen, Zwangsstörungen, Tourette7; s Syndrom und Sucht sind einige der Bedingungen der Behandlung zugänglich durch DBS ^10-12. Während DBS Operation FDA zur Behandlung von Parkinson, Dystonie und essentiellem Tremor genehmigt die Verwendung von DBS für die Behandlung von anderen oben genannten Bedingungen sind in verschiedenen Stadien der Labor- und klinischen Studien mit vielversprechend für Patienten ^13,14.

Klinisch wird DBS Operation in zwei Stufen durchgeführt. Die erste Stufe beinhaltet die chirurgische Positionierung der DBS-Elektroden an der gezielten anatomischen Lage mit einer Kombination aus radiologischen Positionierung, CT, MRT sowie Mikromesswerte für eine verbesserte Präzision. Die zweite Stufe beinhaltet die Implantation eines Impulsgenerators in der oberen Brustkorb des Patienten und die Installation Verlängerungskabel von der Kopfhaut an den Impulsgenerator. Bezogen auf das neurologische Erkrankung, haben mehrere Programmiersysteme für den Pulsgenerator standardisiert und wird verwendet, um die gewünschte Spannung zu liefern. Das Endvolumentage wird stufenweise erreicht, um die besten klinischen Reaktion mit minimaler Spannung ¹⁵ zu empfangen. In unseren Studien, im Gegensatz zu den chronischen DBS Implantate klinisch verwendet wird, für die der Einfachheit halber haben wir uns dem Studium eine einmalige Hochfrequenzstimulation (1 Stunde) in unserem Tiermodell zurückgegriffen.

Ein Teil der Forschung unserer Gruppe konzentriert sich auf die Untersuchung der Verwendung von DBS Operation bei therapierefraktärer Epilepsie. Die stereotaktische chirurgische Ansätze mit Hochfrequenz-Stimulation wurde von vielen anderen als eine wirksame Möglichkeit, medizinisch refraktärer Epilepsie, die etwa 30% aller Fälle von Epilepsie ^10,16,17 bildet Behandlung untersucht. Kleinhirn-Stimulation zur Förderung der kortikalen Oberfläche sowie den tiefen Kleinhirnkerne wurden in der Vergangenheit als Ziele verwendet, um Epilepsie ^10,18,19 behandeln. Darüber hinaus hat Hippocampus Stimulation auch versucht worden, aber mit unterschiedlichen Ergebnissen ^20,21. Einige der anderen untersuchtenDBS Ziele für Epilepsie sind die Großhirnrinde, Thalamus, Nucleus subthalamicus und Vagusnerv ^8. Im Anschluss an die Ergebnisse mehrerer Studien in den letzten Jahren, die vordere Thalamuskern (ATN) hat als die häufigste DBS Ziel für Epilepsie-Behandlung ^10,22 entstanden. Gestützt auf das Wissen über neuroanatomische Schaltung und Erkenntnisse aus Tiermodellen haben verschiedene Studien über die therapeutische Wirkung die tiefe Hirnstimulation der ATN bei der Behandlung von Epilepsie ^23-26 konzentriert. Das ATN ist Teil des limbischen Kreis und ist in der Region des Gehirns, die Anfallshäufigkeit betrifft entfernt. Studien von Hamani et al., Haben die Wirksamkeit von ATN-DBS in einer Pilocarpin induzierten Epilepsie-Modell getestet und festgestellt, dass die bilateralen ATN Stimulation verlängerte Latenzen für Pilocarpin-induzierten Krampfanfällen und Status epilepticus ^24. Darüber hinaus wurde Hochfrequenzstimulation des ATN gefunden Anfallsfrequenz in einem Pentylentetrazol (PTZ) Modell ep reduzierenilepsy ^25,27-29. Lee et al., Haben eine mittlere Reduktion der Anfallshäufigkeit um etwa 75% auf chronische tiefe Hirnstimulation des ATN bei der Behandlung von refraktären partiellen Epilepsie ³⁰ ausgewiesen.

Eine neue klinische Studie zur Behandlung refraktärer Epilepsie hat vielversprechende Ergebnisse nach DBS Operation Ausrichtung der vorderen Thalamuskern (ATN) ²² gezeigt. Eine multizentrische randomisierte Studie mit 110 Patienten, die bilaterale DBS des ATN zur Behandlung refraktärer Epilepsie (SANTE-Studie) zeigte einen Rückgang der Anfallshäufigkeit um etwa 40% ^31. Die Ergebnisse aus dieser Studie deutete auch auf eine verzögerte optimale Antiepileptikum Wirkung 2-3 Monate nach der Operation beobachtet. Weitere Studien von Toda et al., Mit diesen Ergebnissen untermauert, wo sie gezeigt, Neurogenese geschieht zu einem späteren Zeitpunkt nach der DBS (Tage 3-5) im Tiermodell ^ein. Zusätzlich Encinas et al., Haben hippocampalen neurogene gemeldetsis in der erwachsenen Maus Gyrus dentatus nach hochfrequente Stimulation des ATN ^32. Frühere Studien ^33-35 haben sinkende Neurogenese in bestimmten Fällen epileptischen wie chronische Temporallappen-Epilepsie und eine Assoziation mit Lerndefiziten, Gedächtnisstörungen und spontan wiederkehrenden Motorkrampfanfälle berichtet. Weiterhin gab es eine Verringerung in der neuralen Stammzellvorläufer Faktoren wie FGF2 und IGF-1 in der chronisch epileptischen Hippocampus im Tiermodell ^33. In Anbetracht dessen, interventionelle Strategien wie DBS, die eine Steigerung der Neurogenese im Gyrus dentatus zeigen, sind spannende Möglichkeiten für die Forschung. Diese Ergebnisse haben uns ermutigt, weiter tief in den zugrunde liegenden Mechanismus der Neurogenese nach DBS Behandlung für Epilepsie zu erkunden. Wir haben die ATN sowohl einseitig ausgerichtet (Daten nicht angegeben) als auch auf bilateraler Ebene (in repräsentative Ergebnisse) und gesehen erhöht Neurotrophin (BDNF) Ausdruck in den Ratten Gyrus dentatus. Unsere current Hypothese ist, dass die BDNF-Expression initiiert eine Genexpression Kaskade, in der Neurogenese gipfelt, die dem anti-epileptische Wirkung DBS Operation übersetzt. In diesem Artikel präsentieren wir unsere Methoden zur DBS Operation gezielt den ATN bei Ratten, gefolgt von Genexpressionsanalyse als attraktiver Ansatz, um die zugrunde liegende Mechanismus die Vorteile des DBS zu studieren.

Protocol

HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden, werden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für Tierforschung (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren) und werden von der Harvard Medical School IACUC Ausschuss genehmigt. 1. Präoperative Vorbereitung Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente werden entweder durch Autoklavieren oder durch Reinigung mit einer antiseptischen Lösung und / oder Ethanol bei Bedarf …

Representative Results

Die 1A und 1B zeigen die relative Expression von BDNF und GABRD relativ zum Steuer Gen β-Actin. BDNF ist ein Neurotrophin ist oft mit neuroprotektiven Wirkungen in vielen neuronalen Erkrankungen 38-41 verbunden. Es ist daher interessant, das Expressionsprofil von BDNF in Reaktion auf die Stimulation des ATN das therapeutische Vorteile zu epileptischen Patienten ergibt analysieren. In 1A, die das Genexpressionsprofil von BDNF in den angegebenen Zeitpunkten ze…

Discussion

Nach dem Wahrzeichen Arbeit Benabid et al. Bei der Verwendung der tiefen Hirnstimulation zur Behandlung der Parkinson-Krankheit und essentiellem Tremor hat die DBS Operationstechnik mit großem Interesse den letzten zehn Jahren zu vielen neurologischen Erkrankungen ^6,10,43 Behandlung untersucht. DBS Studien Targeting verschiedenen neuroanatomischen Regionen des Gehirns Schaltungen werden derzeit von vielen Gruppen durchgeführt, um wichtige neuronalen Erkrankungen ansprechen und sind in verschiedenen…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500