視床前核の脳深部刺激後のラット海馬における遺伝子発現の変化の解析

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

そのような大脳基底核、視床、及び視床下領域などの脳の様々な領域を標的脳深部刺激（DBS）手術は、薬物療法に応答しなかったいくつかの運動障害のための効果的な治療である。 DBS手術の分野における最近の進歩は、病的肥満、うつ病や強迫性障害など多様な他の条件にこの手術法の適用を拡張するために始めている。これらの拡大兆候にもかかわらず、ほとんどのDBS手術の有益な効果を促進する基盤となる生理学的メカニズムについて知られている。この問題に対する一つのアプローチは、電気刺激を受ける神経細胞における遺伝子発現解析を行うことである。以前の研究では、ラットの歯状回でその神経発生を示している視床¹の前核の標的にDBSに誘発される。 ATNを標的DBS手術は、難治性てんかん治療のために広く使用されている。したがって、多くinteresのです私たちは電気的にATNを刺激することにより誘発される転写の変化を探索するためのT。本稿では、我々は、成体雄WistarラットにATNをターゲットに定位的に誘導DBSの手術のために私たちの方法論を説明します。また、遺伝子発現の変化を測定するための組織切開、RNA単離、cDNA調製および定量的RT-PCRのための後続のステップを議論する。この方法が適用され、一般的に臨床的に標的と大脳基底核および脳の他の領域を刺激するために変更することができる。ここに記載の遺伝子発現研究は、DBSのメカニズムを導くことができる分子のプレイヤーを発見するための標的候補遺伝子アプローチを想定している。

Introduction

電気的に脳回路を刺激する可能性は^2を探索したときの神経外科技術として、脳深部刺激の発展の歴史は1870年代にまでさかのぼります。 1960 ³で起動ニューロンの障害の治療のような慢性の高頻度刺激を使用する。その後、慢性移植DBS電極^4-6の出現により1990年代に、DBSにより処理したニューロンの障害の数が増加し続けた。深部脳刺激は、最初本態性振戦⁶の治療薬として米国で使用された。今日、手術は現在、薬理学的介入によって治療不可能であるニューロンの障害の治療に広く使用されている。 DBSは現在、パーキンソン病およびジストニア^7-9の運動障害を治療するために使用される。アルツハイマー型認知症、ハンチントン病、てんかん、痛みや神経精神疾患、うつ病、OCD、トゥーレット7;症候群と中毒はDBS ^10-12による治療の影響を受けやすい条件のいくつかである。 DBS手術はFDAは、パーキンソン病、ジストニア、および本態性振戦の治療のために承認されているが、前述の他の状態を治療するためのDBSの使用は、患者^13,14に多くの約束を提供する実験室の様々な段階および臨床試験である。

臨床的に、DBS手術は2段階で行われる。第一段階は、外科的に放射線位置の組み合わせを使用して、標的の解剖学的位置にDBS電極を配置することを含む、CT、MRI、ならびに強化精度化微小電極の測定値。第二段階は、患者の胸の上部にパルス発生器を注入し、パルス発生器に頭皮から延長リードを設置することを含む。神経学的状態に基づいて、パルス発生器のためのいくつかのプログラミング方式が標準化され、所望の電圧を供給するために使用される。最終巻最小の電圧¹⁵と最良の臨床応答を受信するように、モンタージュは、段階的に達成される。しかし、我々の研究では、臨床的に使用される慢性DBSインプラントとは異なり、簡単のために、私たちは、動物モデルにおいて（1時間）1回の高頻度刺激を研究に頼ってきた。

当社グループの研究の一部は、治療抵抗性てんかんのためのDBS手術の使用を研究に焦点を当てています。高周波刺激を使用して、定位外科的アプローチは、てんかん^10,16,17の全発生率の約30％を構成する、医学的に難治性てんかんを治療するための効果的なオプションとして、多くの他の人が検討されている。皮質表面を標的小脳刺激ならびに深部小脳核てんかん^10,18,19を治療するための標的として過去に使用されてきた。また、海馬刺激も試みたが、結果はまちまち^20,21とされています。他のいくつかを調べてんかんのためのDBSターゲットは大脳皮質、視床、視床下核と迷走神経^8が含まれ^ています。しかし、過去数年間でいくつかの研究から以下の結果は、視床前核（ATN）は、てんかん治療^10,22のための最も一般的なDBSターゲットとして浮上している。神経解剖学的回路および動物モデルからの所見についての知識に基づいて、いくつかの研究は、てんかん^の治療における^23-26 ATNの深部脳刺激の治療効果に焦点を当てている。 ATNは、辺縁系回路の一部であり、発作頻度に影響する脳の領域に位置している。によるHamani らの研究では、ピロカルピン誘発性てんかんモデルでATN-DBSの有効性をテストし、二国間のATN刺激がピロカルピン誘発性発作とてんかん重積状態²⁴のための待ち時間を延長していることを発見した。さらに、ATNの高周波刺激はディスコグラフィのペンチレンテトラゾール（PTZ）モデルにおける発作頻度を低減することが見出された^25,27-29 ilepsy。 Lee らは 、難治性部分てんかん^30を治療する際にATNの慢性脳深部刺激の際に約75％の発作頻度の平均の減少を報告している。

治療難治性てんかんに関する最近の臨床研究では、視床前核^（ATN）22ターゲットとDBS手術後の有望な結果を示している。治療難治性てんかん（サンテトライアル）用のATNの二国間のDBSを受けた110人の患者との多施設ランダム化臨床試験では、約40％の³¹による発作頻度の低下を示した。この研究からの結果はまた、手術後2〜3ヶ月で観測された遅延最適抗てんかん作用に示唆した。戸田らによるさらなる研究。、彼らは動物モデル¹において、後でポストDBS（日3-5）で起こって神経発生を実証したこれらの知見と裏付け。また、Encinasのら、海馬neurogeneを報告しているATN ³²の高頻度刺激後の成体マウスの歯状回におけるSIS。これまでの研究^33-35は、慢性側頭葉てんかんと学習障害、記憶障害と自発的な再発性運動発作との関連など、特定のてんかんのケースで減少海馬の神経新生を報告している。さらに、このような動物モデル³³における慢性てんかん海馬におけるFGF2およびIGF-1などの神経幹細胞前駆要因の減少があった。これを考慮し、歯状回における神経新生の増加を示しているようなDBSなどのインターベンショナル戦略が研究のための刺激的な道である。これらの知見は、てんかんのための神経発生後のDBS治療の基礎となるメカニズムの中にさらに深く探求する私たちを奨励しています。我々は両方の一方的に（データは報告されていない）だけでなく、左右（代表的な結果で）ATNを目標とし、ラットの歯状回における上昇ニューロトロフィン（BDNF）の発現を見てきました。私たちのCurrent仮説はBDNF発現は、DBSの手術の抗てんかん効果に変換神経新生で最高潮に達した遺伝子発現カスケードを開始するということです。本稿では、DBSの恩恵を根底にあるメカニズムを研究するための魅力的なアプローチとして、遺伝子発現解析に続いて、ラットにおいてATNをターゲットとDBSの手術のための私達の方法を提示する。

Protocol

注：倫理に関する声明：この原稿で説明するすべての手順は動物研究（実験動物の管理と使用に関する指針）のためのNIHガイドラインに従っているとハーバード大学医学部IACUC委員会によって承認されている。 1.手術前の準備すべての外科器具はどちらオートクレーブによりまたは必要に応じて消毒液および/またはエタノールで洗浄することによって滅菌されて?…

Representative Results

図1A及び図1Bは、対照遺伝子βアクチンのBDNFおよびGABRDの相対発現を示す。 BDNFは、ニューロトロフィンは、多くの場合、多くの神経疾患38-41で神経保護効果と関連している。それはてんかん患者に治療上の利益をもたらすATNの刺激に応答してBDNFの発現プロファイルを分析することは興味深い。 DBS刺激ポスト示された時点にわたってBDNFの遺伝子発現プロファ?…

Discussion

Benabid らによる画期的な仕事の後。パーキンソン病と本態性振戦を治療するための脳深部刺激を使用して、DBS手術法は、多くの神経疾患の^6,10,43を治療するための過去10年間で多くの関心を検討されている。脳回路の様々な神経解剖学的領域を標的DBS研究は、現在、主要な神経疾患に対処するために多くのグループによって実行され、臨床試験の様々な段階にあるされて?…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500