Analyse des modifications d'expression génique dans l'hippocampe de rat après stimulation cérébrale profonde de l'antérieur thalamique Nucleus

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

La stimulation cérébrale profonde (DBS) chirurgie, en ciblant différentes régions du cerveau telles que les noyaux gris centraux, le thalamus, et les régions sous-thalamique, est un traitement efficace pour plusieurs troubles du mouvement qui ne ont pas répondu au médicament. Les progrès récents dans le domaine de la chirurgie DBS a commencé à étendre l'application de cette technique chirurgicale à d'autres conditions aussi diverses que l'obésité morbide, la dépression et le trouble obsessionnel compulsif. Malgré ces indications en expansion, on en sait peu sur les mécanismes physiologiques sous-jacents qui facilitent les effets bénéfiques de la chirurgie DBS. Une approche pour cette question consiste à effectuer une analyse de l'expression des gènes dans les neurones qui reçoivent la stimulation électrique. Des études antérieures ont montré que la neurogénèse dans le gyrus denté de rat est obtenue chez DBS ciblage du noyau antérieur du thalamus ^1. La chirurgie DBS ciblant l'ATN est largement utilisé pour le traitement de l'épilepsie réfractaire. Il est donc beaucoup interest pour nous d'explorer les changements de transcription induits par stimulation électrique du ATN. Dans ce manuscrit, nous décrivons nos méthodologies pour la chirurgie stéréotaxique DBS-guidée ciblant l'ATN chez des rats Wistar mâles adultes. On discute également les étapes suivantes pour la dissection de tissu, isolement de l'ARN, la préparation d'ADNc et RT-PCR quantitative pour mesurer les changements d'expression génique. Cette méthode peut être appliquée à jour et pour stimuler les noyaux gris centraux et d'autres régions du cerveau communément cliniquement ciblée. L'étude de l'expression du gène décrit ici suppose une approche de gène cible candidat pour découvrir acteurs moléculaires qui pourraient être diriger le mécanisme de DBS.

Introduction

L'histoire derrière le développement de la stimulation cérébrale profonde comme une technique neurochirurgicale remonte aux années 1870 lorsque la possibilité de stimuler électriquement les circuits du cerveau a été explorée ^2. L'utilisation de la stimulation chronique à haute fréquence pour le traitement de troubles neuronaux a commencé dans les années 1960 ^3. Plus tard dans les années 1990 avec l'avènement de l'implantation chronique DBS électrodes ^4-6, le nombre de troubles neuronaux qui ont été traités par DBS a continué d'augmenter. La stimulation cérébrale profonde a été utilisé pour la première aux États-Unis comme traitement pour le tremblement essentiel ^6. Aujourd'hui, la chirurgie est largement utilisé pour traiter les troubles neuronaux qui sont actuellement incurable par une intervention pharmacologique. DBS est actuellement utilisé pour traiter les troubles du mouvement de la maladie de Parkinson et la dystonie ^7-9. La démence de type Alzheimer, la maladie, l'épilepsie, la douleur et les maladies neuropsychiatriques tels dépression de Huntington, OCD, Tourette7; le syndrome et la dépendance de quelques-unes des conditions qui se prêtent à un traitement par DBS ^10-12. Alors que la chirurgie DBS est approuvé par la FDA pour le traitement de la maladie de Parkinson, la dystonie et le tremblement essentiel, l'utilisation de la SCP pour traiter d'autres conditions mentionnées ci-dessus sont à divers stades de laboratoire et des études cliniques qui offrent beaucoup de promesses aux patients ^13,14.

Cliniquement, la chirurgie DBS est effectuée en deux étapes. La première étape consiste à positionner les électrodes chirurgicalement DBS à la localisation anatomique ciblée utilisant une combinaison de positionnement radiologique, CT, IRM ainsi que des lectures de microélectrodes pour une précision accrue. La deuxième étape consiste à implanter un générateur d'impulsions en haut de la poitrine du patient et l'extension de l'installation conduit à partir du cuir chevelu du générateur d'impulsions. Sur la base de l'état neurologique, plusieurs régimes de programmation pour le générateur d'impulsions ont été normalisés et seront utilisés pour fournir la tension souhaitée. Le vol finaletage est atteint de manière progressive afin de recevoir la meilleure réponse clinique avec une tension minimale ^15. Cependant, dans nos études, contrairement aux implants DBS chroniques utilisé cliniquement, pour des raisons de simplicité, nous avons recours à l'étude d'une stimulation à haute fréquence unique (pendant 1 heure) dans nos modèles animaux.

Une partie de la recherche de notre groupe se concentre sur l'étude de l'utilisation de la chirurgie DBS pour le traitement de l'épilepsie réfractaire. Approches chirurgicales stéréotaxiques utilisant stimulation à haute fréquence a été exploré par beaucoup d'autres comme une option efficace pour traiter l'épilepsie médicalement réfractaire qui constitue environ 30% de tous les cas d'épilepsie ^10,16,17. Stimulation cérébelleuse ciblant la surface corticale ainsi que les noyaux cérébelleux profonds ont été utilisés dans le passé en tant que cibles pour traiter l'épilepsie ^10,18,19. En outre, la stimulation de l'hippocampe a également été essayé, mais avec des résultats mitigés ^20,21. Une partie de l'autre objet d'une enquêteDBS objectifs pour l'épilepsie comprennent le cortex cérébral, le thalamus, noyau sous-thalamique et nerf vague ^8. Cependant, les résultats suivants de plusieurs études au cours des dernières années, le noyau antérieur du thalamus (ATN) a émergé comme la cible la plus commune DBS pour le traitement de l'épilepsie ^10,22. Sur la base de connaissances sur les circuits et les résultats de modèles animaux neuroanatomiques, plusieurs études ont porté sur l'effet thérapeutique de la stimulation cérébrale profonde de l'ATN dans le traitement de l'épilepsie ^23-26. L'ATN est une partie du circuit limbique et est situé dans la région du cerveau qui affecte la fréquence des crises. Des études menées par Hamani et al., Ont testé l'efficacité de l'ATN-DBS dans un modèle de l'épilepsie de pilocarpine induit et constaté que la stimulation bilatérale ATN latences pour les convulsions induites par la pilocarpine et état ​​de mal épileptique ²⁴ prolongée. En outre, la stimulation à haute fréquence de l'ATN a été trouvé pour réduire la fréquence des crises dans un modèle pentylenetetrazol (PTZ) de epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Ont rapporté une réduction moyenne de la fréquence des crises d'environ 75% lors de la stimulation cérébrale profonde chronique de l'ATN dans le traitement de l'épilepsie partielle réfractaire ^30.

Une étude clinique récente sur le traitement de l'épilepsie réfractaire a montré des résultats prometteurs après la chirurgie DBS ciblant le noyau antérieur du thalamus (ATN) ^22. Un essai clinique randomisé multicentrique de 110 patients subissant DBS bilatérale de l'ATN pour le traitement de l'épilepsie réfractaire (essai SANTE) a indiqué une baisse de la fréquence des crises d'environ 40% ^31. Les résultats de cette étude a également laissé entendre sur un effet anti-épileptique optimale retard observé à la chirurgie de poste 2-3 mois. D'autres études par Toda et al., Corroborés avec ces conclusions où ils ont démontré la neurogenèse se passe à un poste plus tard DBS (jours 3-5) dans des modèles animaux ^une. En outre, Encinas et al., Ont rapporté neurogène hippocampiquesis dans la souris adulte dentate gyrus après stimulation à haute fréquence de l'ATN ^32. Des études antérieures ont signalé la baisse ^{de 33 à 35} neurogenèse hippocampique dans certains cas d'épilepsie comme l'épilepsie du lobe temporal chronique et une association avec des déficits d'apprentissage, troubles de la mémoire et des crises spontanées automobiles récurrentes. En outre, il y avait une réduction des facteurs de neurales progénitrices de cellules souches tels que le FGF2 et d'IGF-1 dans l'hippocampe épilepsie chronique chez des modèles animaux ^33. Considérant cela, stratégies d'intervention tels que DBS qui montrent une augmentation de la neurogenèse dans le gyrus denté sont des avenues intéressantes pour la recherche. Ces résultats nous ont encouragés à explorer plus profondément dans le mécanisme sous-jacent de traitement neurogenèse post-DBS pour l'épilepsie. Nous avons ciblé l'ATN tant de manière unilatérale (données non communiquées) ainsi que bilatéralement (des résultats représentatifs) et vu neurotrophine élevé (BDNF) expression dans le gyrus denté de rat. Notre cdusyst hypothèse est que l'expression de BDNF initie une cascade expression génique qui culmine dans la neurogenèse qui se traduit par l'effet anti-épileptique de chirurgie DBS. Dans cet article, nous présentons nos méthodes pour la chirurgie DBS ciblant l'ATN chez les rats suivie d'une analyse de l'expression des gènes comme une approche intéressante pour étudier le mécanisme qui sous-tend les avantages de la DBS.

Protocol

NOTE: Éthique Déclaration: Tous les procédures décrites dans ce manuscrit sont conformes aux directives du NIH pour la recherche animale (Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire) et sont approuvés par l'École de médecine de Harvard Comité IACUC. Préparation 1. Pré-chirurgicale Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés par autoclavage soit ou en nettoyant avec une solution et / ou de l'éthanol antiseptique si …

Representative Results

Les figures 1A et 1B montrent l'expression relative de BDNF et GABRD par rapport au gène de la β-actine de contrôle. BDNF, une neurotrophine est souvent associée à des effets neuroprotecteurs dans de nombreuses maladies neuronales 38-41. Il est donc intéressant d'analyser le profil d'expression du BDNF en réponse à la stimulation de l'ATN qui donne un bénéfice thérapeutique aux patients épileptiques. Sur la figure 1A qui montre le …

Discussion

Suite à l'ouvrage de référence par Benabid et al. Dans l'utilisation de la stimulation cérébrale profonde pour traiter la maladie de Parkinson et le tremblement essentiel, la technique chirurgicale DBS a été étudié avec beaucoup d'intérêt au cours de la dernière décennie pour traiter de nombreux troubles neurologiques ^6,10,43. DBS études ciblant différentes régions neuro-anatomique du circuit du cerveau sont actuellement effectuées par de nombreux groupes pour traiter les…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500