Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Stimolazione cerebrale profonda (DBS) Chirurgia, mira diverse regioni del cervello, come i gangli basali, talamo, e le regioni subtalamico, è un trattamento efficace per diversi disturbi del movimento che non sono riusciti a rispondere ai farmaci. I recenti progressi nel campo della chirurgia DBS ha iniziato a estendere l'applicazione di questa tecnica chirurgica per altre condizioni diverse come obesità patologica, depressione e disturbo ossessivo compulsivo. Nonostante queste indicazioni in espansione, si sa ancora poco sui meccanismi fisiologici di base che facilitano gli effetti benefici della chirurgia DBS. Un approccio a questa domanda è quello di eseguire analisi di espressione genica nei neuroni che ricevono la stimolazione elettrica. Precedenti studi hanno dimostrato che la neurogenesi nel giro dentato di ratto è suscitato in DBS mira del nucleo anteriore del talamo ^1. Chirurgia DBS mira il ATN è ampiamente utilizzato per il trattamento di epilessia refrattaria. E 'quindi di molto interest per noi per esplorare i cambiamenti trascrizionali indotte stimolando elettricamente il ATN. In questo manoscritto, descriviamo le nostre metodologie per la chirurgia DBS stereotassica guidata mira la ATN in adulti ratti maschi Wistar. Discutiamo anche i passi successivi per la dissezione dei tessuti, l'isolamento di RNA, la preparazione cDNA e RT-PCR quantitativa per misurare i cambiamenti di espressione genica. Questo metodo può essere applicato e modificate per stimolare i gangli basali e altre regioni del cervello comunemente clinicamente mirata. Lo studio dell'espressione genica descritto qui assume un approccio del gene bersaglio candidato per scoprire attori molecolari che potrebbero essere dirigere il meccanismo di DBS.

Introduction

La storia dietro lo sviluppo di stimolazione cerebrale profonda come tecnica neurochirurgica risale al 1870, quando è stata esplorata la possibilità di stimolare elettricamente il circuito cerebrale ^2. L'uso della stimolazione ad alta frequenza cronica come trattamento per disturbi neuronali iniziato nel 1960 ^3. Successivamente nel 1990 con l'avvento di impiantazione cronica DBS elettrodi ^4-6, il numero di disturbi neuronali che sono stati trattati con DBS continuato ad aumentare. Stimolazione cerebrale profonda è stato utilizzato negli Stati Uniti come trattamento per il tremore essenziale ^6. Oggi l'intervento è ampiamente utilizzato per il trattamento di disturbi neuronali che sono attualmente incurabili dall'intervento farmacologico. DBS è attualmente utilizzato per il trattamento di disturbi del movimento del morbo di Parkinson e distonia ^7-9. Alzheimer tipo di demenza, la malattia, l'epilessia, il dolore e le malattie neuropsichiatriche come la depressione di Huntington, OCD, Tourette7; s sindrome e la dipendenza sono alcune delle condizioni suscettibili di trattamento con DBS ^10-12. Mentre la chirurgia DBS è approvato dalla FDA per il trattamento del morbo di Parkinson, distonia e tremore essenziale, l'utilizzo di DBS per il trattamento di altre condizioni di cui sopra sono in varie fasi di laboratorio e studi clinici che offrono molte promesse ai pazienti ^13,14.

Clinicamente, la chirurgia DBS viene eseguita in due fasi. La prima fase consiste chirurgicamente posizionamento degli elettrodi DBS nella posizione anatomica mirata utilizzando una combinazione di posizionamento radiologica, CT, MRI e letture di microelettrodi per una maggiore precisione. La seconda fase prevede l'impianto di un generatore di impulsi nella parte superiore del torace del paziente e l'estensione installazione conduce dal cuoio capelluto al generatore di impulsi. Sulla base della condizione neurologica, diversi schemi di programmazione per il generatore di impulsi sono stati standardizzati e vengono utilizzati per fornire la tensione desiderata. Il vol finaletage viene raggiunta in modo graduale in modo da ricevere la migliore risposta clinica con la minima tensione ^15. Tuttavia, nei nostri studi, a differenza degli impianti croniche DBS usato in clinica, per semplicità, si è fatto ricorso a studiare una stimolazione ad alta frequenza di una volta (per 1 ora) nei nostri modelli animali.

Parte della ricerca del nostro gruppo si concentra sullo studio l'uso della chirurgia DBS per il trattamento-refrattaria epilessia. Approcci chirurgici stereotassica con stimolazione ad alta frequenza è stato esplorato da molti altri come un'opzione efficace per il trattamento dell'epilessia medico-refrattario che costituisce circa il 30% di tutti i casi di epilessia ^10,16,17. Stimolazione cerebellare mira la superficie corticale, nonché i nuclei profondi del cervelletto sono stati utilizzati in passato come bersagli per il trattamento dell'epilessia ^10,18,19. Inoltre, la stimolazione ippocampo è stato anche provato ma con risultati alterni ^20,21. Alcuni degli altri indagatiObiettivi DBS per l'epilessia comprendono la corteccia cerebrale, nel talamo, nucleo subtalamico e nervo vago ^8. Tuttavia, a seguito dei risultati di diversi studi negli ultimi anni, il nucleo del talamo anteriore (ATN) è emerso come la destinazione più comune DBS per il trattamento dell'epilessia ^10,22. Sulla base delle conoscenze su circuiti neuroanatomici e risultati di modelli animali, molti studi si sono concentrati sull'effetto terapeutico di stimolazione cerebrale profonda del ATN nel trattamento dell'epilessia ^23-26. La ATN è parte del circuito limbico e si trova nella regione del cervello che colpisce frequenza delle crisi. Gli studi di Hamani et al., Hanno testato l'efficacia di ATN-DBS in un pilocarpina indotta modello di epilessia e ha scoperto che la stimolazione bilaterale ATN latenze per convulsioni pilocarpina indotta e lo stato epilettico prolungato ^24. Inoltre, la stimolazione ad alta frequenza della ATN è stato trovato per ridurre la frequenza delle crisi in un pentylenetetrazol (PTZ) il modello di epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Hanno riportato una riduzione media della frequenza delle crisi di circa il 75% al momento della stimolazione cerebrale profonda cronica della ATN nel trattamento epilessia parziale refrattaria ^30.

Un recente studio clinico sul trattamento dell'epilessia refrattaria ha mostrato risultati promettenti dopo l'intervento chirurgico DBS rivolte al nucleo talamico anteriore (ATN) ^22. Uno studio clinico multicentrico randomizzato con 110 pazienti sottoposti a DBS bilaterale del ATN per il trattamento dell'epilessia refrattaria (prova SANTE) ha indicato una diminuzione della frequenza delle crisi di circa il 40% ^31. I risultati di questo studio ha anche accennato a un effetto anti-epilettico ottimale ritardo osservato 2-3 mesi dopo l'intervento chirurgico. Ulteriori studi di Toda et al., Corroborate con questi risultati in cui hanno dimostrato neurogenesi accadendo in un momento post successivo DBS (giorni 3-5) in modelli animali ^1. Inoltre, Encinas et al., Hanno riportato neurogena hippocampalsis nel topo adulto giro dentato dopo stimolazione ad alta frequenza della ATN ^32. Precedenti studi hanno segnalato in calo ^33-35 neurogenesi ippocampale in alcuni casi di epilessia come l'epilessia del lobo temporale cronica e un'associazione con deficit di apprendimento, disturbi della memoria e spontanee crisi motorie ricorrenti. Inoltre, c'è stata una riduzione in fattori neurali progenitrici di cellule staminali, come FGF2 e IGF-1 nell'ippocampo cronicamente epilettico in modelli animali ^33. Considerando questo, strategie di intervento come la DBS che mostrano un aumento della neurogenesi nel giro dentato sono strade interessanti per la ricerca. Questi risultati ci hanno incoraggiato a esplorare ulteriormente in profondità nel meccanismo sottostante trattamento neurogenesi post-DBS per l'epilessia. Abbiamo preso di mira il ATN sia unilateralmente (dati non riportati) e bilaterale (in risultati rappresentativi) e visto elevati neurotrofina (BDNF) espressione del giro dentato di ratto. Il nostro corrente ipotesi è che l'espressione di BDNF avvia una cascata di espressione genica che culmina in neurogenesi che traduce l'effetto anti-epilettico di chirurgia DBS. In questo articolo presentiamo i nostri metodi per la chirurgia DBS mira la ATN nei ratti seguita da analisi di espressione genica come approccio interessante per studiare il meccanismo alla base dei benefici di DBS.

Protocol

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le linee guida NIH per la ricerca animale (Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio) e sono approvati dalla Scuola Medica Comitato IACUC Harvard. Preparazione 1. Pre-chirurgica Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave sia o la pulizia con soluzione antisettica e / o etanolo, se necessario. Se possibile, utilizzare materiale monou…

Representative Results

Le figure 1A e 1B mostrano la relativa espressione di BDNF e GABRD rispetto al gene di controllo β-actina. BDNF, una neurotrofina è spesso associata a effetti neuroprotettivi in molte malattie neuronali 38-41. È quindi interessante analizzare il profilo di espressione di BDNF in risposta alla stimolazione della ATN che produce benefici terapeutici per pazienti epilettici. Nella figura 1A che mostra il profilo di espressione genica del BDNF attraverso i pun…

Discussion

Dopo il lavoro di riferimento per Benabid et al. Utilizzando la stimolazione cerebrale profonda per il trattamento di malattia di Parkinson e tremore essenziale, la tecnica chirurgica DBS è stata studiata con molto interesse negli ultimi dieci anni per il trattamento di molti disturbi neurologici ^6,10,43. Studi DBS rivolti varie regioni neuro-anatomica del circuito cerebrale sono attualmente svolte da molti gruppi per affrontare le principali malattie neuronali e sono in varie fasi di sperimentazion…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500