Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Deep Brain Stimulation (DBS) kirurgi, målrettet forskellige områder i hjernen, som den basale ganglier, thalamus, og subthalamisk regioner, er en effektiv behandling for flere bevægelsesforstyrrelser, der ikke har reageret på medicin. Nylige fremskridt inden for DBS kirurgi er begyndt at udvide anvendelsen af ​​denne kirurgisk teknik til andre forhold så forskellige som morbid fedme, depression og obsessiv-kompulsiv sygdom. På trods af disse ekspanderende indikationer, vides der kun lidt om de underliggende fysiologiske mekanismer, som letter de gavnlige virkninger af DBS kirurgi. En metode til dette spørgsmål er at udføre genekspressionsanalyse i neuroner, der modtager den elektriske stimulation. Tidligere undersøgelser har vist, at neurogenese i rotte gyrus dentatus fremkaldes i DBS målretning af den forreste kerne af thalamus ^1. DBS kirurgi målretning ATN anvendes bredt til behandling refraktær epilepsi. Det er således af meget interest for os at udforske de transkriptionelle forandringer som følge af elektrisk stimulering af ATN. I dette manuskript, beskriver vi vores metoder til stereotaktisk guidet DBS operation rettet mod ATN hos voksne Wistar rotter. Vi diskuterer også de efterfølgende trin for væv dissektion, RNA isolering, cDNA forberedelse og kvantitativ RT-PCR til måling af genekspression ændringer. Denne metode kunne anvendes og modificeres til at stimulere basalganglierne og andre regioner af hjernen almindeligt klinisk målrettede. Den genekspression undersøgelse beskrevet her antager en kandidat målgen tilgang for at opdage molekylære spillere, der kunne dirigere mekanismen for DBS.

Introduction

Historien bag udviklingen af Deep Brain Stimulation som neurokirurgisk teknik går tilbage til 1870'erne, hvor muligheden for elektrisk stimulere hjernen kredsløb blev udforsket ^2. Brugen af kronisk højfrekvent stimulering som behandling for neuronale lidelser startede i 1960'erne ^3. Senere i 1990'erne med fremkomsten af kronisk implantation DBS elektroder ^4-6, antallet af neuronale lidelser, der blev behandlet af DBS fortsatte med at stige. Deep Brain Stimulation blev første gang brugt i USA til behandling af essentiel tremor ^6. I dag operationen anvendes bredt til behandling af neuronale lidelser, der i øjeblikket uhelbredelige af farmakologisk intervention. DBS er i øjeblikket anvendes til behandling af bevægelsesforstyrrelser på Parkinsons sygdom og dystoni ^7-9. Alzheimers demens, Huntingtons sygdom, epilepsi, smerte og neuropsykiatriske sygdomme, såsom depression, OCD, Tourette7; s syndrom og afhængighed er nogle af de betingelser, der er modtagelige for behandling af DBS ^10-12. Mens DBS kirurgi er FDA godkendt til behandling af Parkinsons sygdom, dystoni og essentiel tremor, anvendelse af DBS til behandling af andre tilstande, der er nævnt ovenfor, er i forskellige stadier af lab og kliniske studier, der tilbyder meget løfte til patienter ^13,14.

Klinisk er DBS operation udføres i to faser. Den første fase omfatter kirurgisk placering af DBS elektroderne på det målrettet anatomiske placering ved hjælp af en kombination af radiologisk positionering, CT, MR samt mikroelektrode aflæsninger for øget præcision. Det andet trin indebærer implantere en impulsgenerator i patientens øvre bryst og installere forlængerledninger fra hovedbunden til impulsgeneratoren. Baseret på den neurologiske tilstand har flere programmering ordninger for impulsgeneratoren blevet standardiseret og vil blive anvendt til at levere den ønskede spænding. Den endelige volTage er nået på en trinvis måde for at modtage den bedste kliniske respons med minimal spænding ^15. Men i vores studier, i modsætning til de kroniske DBS implantater anvendes klinisk, for overskuelighedens skyld, har vi tyet til at studere en engangs-højfrekvent stimulering (1 time) i vores dyremodeller.

En del af vores gruppe forskning fokuserer på at undersøge brugen af ​​DBS kirurgi til behandling-resistent epilepsi. Stereotaktisk kirurgiske metoder, der anvender højfrekvent stimulation er blevet undersøgt af mange andre som et effektivt alternativ til behandling af medicinsk refraktær epilepsi, som udgør omkring 30% af alle tilfælde af epilepsi ^10,16,17. Cerebellare stimulation målrette kortikale overflade samt de dybe cerebellare kerner er blevet anvendt i fortiden som mål til behandling af epilepsi ^10,18,19. Derudover har hippocampus stimulation også været forsøgt, men med blandede resultater ^20,21. Nogle af de andre undersøgteDBS mål for epilepsi omfatter cerebral cortex, thalamus, subthalamisk kerne og vagus nerve ^8. Men følgende resultater fra flere studier i de seneste par år, har den forreste thalamiske kerne (ATN) vist sig som den mest almindelige DBS mål for epilepsi behandling ^10,22. Baseret på viden om neuroanatomiske kredsløb og resultater fra dyremodeller, har flere undersøgelser fokuseret på den terapeutiske virkning af deep brain stimulation af ATN behandling af epilepsi ^23-26. ATN er en del af det limbiske kredsløb og er placeret i området af hjernen, der påvirker hyppigheden af ​​anfald. Undersøgelser foretaget af Hamani et al., Har testet effekten af ATN-DBS i en pilocarpin-induceret epilepsi model og fandt, at den bilaterale ATN stimulation forlænget latenstider for pilocarpin-inducerede anfald og status epilepticus ^24. Endvidere blev højfrekvent stimulering af ATN sig at reducere hyppigheden af ​​anfald i en pentylentetrazol (PTZ) model af epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Har rapporteret en gennemsnitlig reduktion i anfaldshyppighed med omkring 75% ved kronisk dyb brain stimulation af ATN i behandling refraktær partiel epilepsi ^30.

En nylig klinisk undersøgelse af behandling-resistent epilepsi har vist lovende resultater efter DBS operation rettet mod forreste thalamiske kerne (ATN) ^22. En multicenter randomiseret klinisk forsøg med 110 patienter, der gennemgik bilateral DBS for ATN til behandling ildfast epilepsi (SANTE forsøg) viste en nedgang i hyppigheden af anfald med ca. 40% ^31. Resultaterne fra denne undersøgelse også antydet på en forsinket optimal antiepileptisk effekt observeret ved 2-3 måneder postoperativt. Yderligere undersøgelser af Toda et al., Bekræftede med disse resultater, hvor de demonstrerede neurogenese sker på et senere tidspunkt post DBS (dage 3-5) i dyremodeller ^1. Desuden Encinas et al., Har rapporteret hippocampus neurogenesis i voksne mus gyrus dentatus efter højfrekvent stimulering af ATN ^32. Tidligere undersøgelser ^33-35 har rapporteret faldende hippocampus neurogenese i visse epileptiske tilfælde som kronisk FLE og en forening med læring underskud, hukommelsessvækkelse og spontane tilbagevendende motoriske anfald. Desuden var der en reduktion i neurale stamceller progenitor faktorer såsom FGF2 og IGF-1 i kronisk epileptiske hippocampus i dyremodeller ^33. I betragtning af dette, interventionelle strategier såsom DBS, der viser en forøgelse af neurogenese i den tandede gyrus er spændende muligheder for forskning. Disse resultater har tilskyndet os til at udforske yderligere dybt ind i mekanismen underliggende neurogenese efter DBS behandling for epilepsi. Vi har målrettet den ATN både ensidigt (data ikke rapporteret) samt bilateralt (i repræsentative resultater) og set forhøjede neurotrofin (BDNF) udtryk i rotte gyrus dentatus. Vores cNUVÆRENDE hypotese er, at BDNF udtryk initierer en genekspression kaskade, der kulminerer i neurogenese, der oversætter til den anti-epileptiske virkning DBS kirurgi. I denne artikel præsenterer vi vores metoder til DBS kirurgi målretning ATN hos rotter efterfulgt af genekspression analyse som en attraktiv tilgang til at undersøge den mekanisme, der ligger til grund fordelene ved DBS.

Protocol

BEMÆRK: Etik Statement: Alle procedurer der omtales i dette manuskript er i overensstemmelse med NIH retningslinjer for Animal Research (Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr) og er godkendt af Harvard Medical School IACUC udvalg. 1. Pre-kirurgisk Forberedelse Kontroller, at alle kirurgiske instrumenter steriliseres ved enten autoklavering eller ved udrensning med antiseptisk opløsning og / eller ethanol som nødvendigt. Hvor det er muligt, brug sterilt engangsudstyr sås…

Representative Results

1A og 1B viser den relative ekspression af BDNF og GABRD forhold til kontrollen gen β-actin. BDNF er et neurotrophin ofte forbundet med neurobeskyttende virkninger i mange neuronale sygdomme 38-41. Det er derfor interessant at analysere ekspressionen profil BDNF som respons på stimulering af ATN som giver terapeutiske fordele til epileptiske patienter. I figur 1A, som viser genekspressionsprofilen BDNF over de angivne tidspunkter skrive DBS stimulation, BDN…

Discussion

Efter den skelsættende arbejde af Benabid et al. I at bruge deep brain stimulation til behandling af Parkinsons sygdom og essentiel tremor har DBS kirurgiske teknik blevet undersøgt med stor interesse i det seneste årti til at behandle mange neurologiske lidelser ^6,10,43. DBS undersøgelser er rettet mod forskellige neuro-anatomiske områder af hjernen kredsløb i øjeblikket udføres af mange grupper til at løfte større neuronale sygdomme og er i forskellige stadier af kliniske forsøg. Stimule…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500