Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Dyp hjernestimulering (DBS) kirurgi, målretting ulike regioner av hjernen som basalgangliene, thalamus, og subthalamic regioner, er en effektiv behandling for flere bevegelsesforstyrrelser som ikke har respondert på medisinering. Nylige fremskritt innen DBS kirurgi har begynt å utvide anvendelsen av denne kirurgiske teknikken til andre forhold så forskjellige som sykelig fedme, depresjon og tvangslidelser. Til tross for disse voksende indikasjoner, lite er kjent om de underliggende fysiologiske mekanismer som letter de gunstige effektene av DBS kirurgi. En tilnærming til dette spørsmålet er genekspresjonsanalyser å utføre i nevroner som mottar elektrisk stimulering. Tidligere studier har vist at nevrogenesen i rotte dentate gyrus utløses i DBS målretting av fremre kjernen i thalamus ^1. DBS kirurgi rettet mot ATN brukes mye for behandling ildfast epilepsi. Det er derfor av mye interest for oss å utforske transkripsjons endringer indusert av elektrisk stimulering av ATN. I dette manuskriptet, beskriver vi våre metoder for stereotaktisk styrt DBS kirurgi rettet mot ATN hos voksne mannlige Wistar rotter. Vi diskuterer også de påfølgende trinnene for vev disseksjon, RNA isolering, cDNA forberedelse og kvantitativ RT-PCR for å måle genuttrykk endringer. Denne metoden kan bli anvendt og modifisert for å stimulere de basale ganglier og andre områder av hjernen som vanligvis klinisk målrettet. Genuttrykket studien beskrevet her forutsetter en kandidat målgen tilnærming for å oppdage molekylære spillere som kunne dirigere mekanismen for DBS.

Introduction

Historien bak utviklingen av dyp hjernestimulering som en nevrokirurgisk teknikk dateres tilbake til 1870-tallet da muligheten for elektrisk stimulere hjernen kretser ble utforsket ^to. Bruken av kronisk høy frekvens stimulering som behandling for nevronale lidelser startet i 1960 ^tre. Senere på 1990-tallet med bruk av kronisk implantasjon DBS elektroder ^4-6, fortsatte antall nevronale lidelser som ble behandlet av DBS å øke. Dyp hjernestimulering ble først brukt i USA som en behandling for essensiell tremor ^6. I dag er kirurgi er brukt mye til å behandle nervelidelser som for øyeblikket er botemiddel ved farmakologisk intervensjon. DBS i dag brukes for å behandle problemer på Parkinsons sykdom og dystoni ^7-9. Alzheimers type demens, Huntingtons sykdom, epilepsi, smerte og nevropsykiatriske sykdommer, slik depresjon, OCD, Tourettes7; s syndrom og avhengighet er noen av de forholdene som kan behandles ved DBS ^10-12. Mens DBS kirurgi er godkjent av FDA for behandling av Parkinsons sykdom, dystoni og essensiell tremor, bruk av DBS for behandling av andre tilstander som er nevnt ovenfor er i forskjellige faser av lab og kliniske studier som gir mye løftet til pasienter ^13,14.

Klinisk er DBS operasjonen utføres i to trinn. Den første fasen innebærer kirurgisk plassere DBS elektroder på målrettet anatomisk plassering ved hjelp av en kombinasjon av radiologisk posisjonering, CT, MR samt microelectrode avlesninger for økt presisjon. Det andre trinn involverer å implantere en pulsgenerator i pasientens øvre bryst og installering av skjøteledninger fra hodebunnen til pulsgeneratoren. Basert på den nevrologisk tilstand, har flere programmeringsskjemaer for pulsgeneratoren blitt standardisert og vil bli brukt for å levere den ønskede spenning. Den endelige voltage er nådd i en stegvis slik som å motta den beste klinisk respons med minimal spenning ^15. Men i våre studier, i motsetning til den kroniske DBS implantater anvendes klinisk, for enkelhets skyld har vi tydd til å studere en engangs høyfrekvent stimulering (1 time) i våre dyremodeller.

En del av vår gruppe forskning fokuserer på å undersøke bruk av DBS kirurgi for behandling-refraktær epilepsi. Stereotaktisk kirurgiske tilnærminger ved hjelp av høyfrekvent stimulering har blitt utforsket av mange andre som et effektivt alternativ for å behandle medisinsk-refraktær epilepsi som utgjør ca 30% av alle tilfeller av epilepsi ^10,16,17. Lillehjernen stimulering rettet kortikale overflate samt de dype cerebellare atomkjerner har blitt brukt i fortiden som mål å behandle epilepsi ^10,18,19. I tillegg har hippocampus stimulering også blitt forsøkt, men med blandede resultater ^20,21. Noen av de andre undersøkteDBS mål for epilepsi inkluderer hjernebarken, thalamus, subthalamic nucleus og vagus nerve ^8. Men følgende resultater fra flere studier de siste årene, har den fremre thalamic kjernen (ATN) dukket opp som den mest vanlige DBS mål for epilepsi behandling ^10,22. Basert på kunnskap om nevroanatomi kretser og resultatene fra dyremodeller, har flere studier rettet mot den terapeutiske effekten av dyp hjerne stimulering av ATN i behandling av epilepsi ^23-26. ATN er en del av det limbiske krets og ligger i regionen av hjernen som påvirker anfallsfrekvens. Studier av Hamani et al., Har testet effekten av ATN-DBS i en pilokarpin indusert epilepsi modell og fant at bilateral ATN stimulering forlenget latenstid for pilokarpin-induserte anfall og status epilepticus ^24. Videre ble høyfrekvent stimulering av ATN funnet å redusere anfallsfrekvens i en pentylentetrazol (PTZ) modell av epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Har rapportert en gjennomsnittlig reduksjon i anfallsfrekvens med om lag 75% ved kronisk dyp hjernestimulering av ATN i behandling ildfast partiell epilepsi ^30.

En fersk klinisk studie på behandling-refraktær epilepsi har vist lovende resultater etter DBS kirurgi rettet mot fremre thalamic kjernen (ATN) ^22. En multisenter randomisert klinisk studie med 110 pasienter som gjennomgår bilateral DBS av ATN for behandling refraktær epilepsi (SANTE rettssaken) indikerte en nedgang i anfallsfrekvens med ca 40% ^31. Resultatene fra denne studien også antydet på en forsinket optimal antiepileptisk effekt observert på 2-3 måneder etter operasjonen. Videre studier av Toda et al., Bekreftet med disse funnene der de demonstrerte neurogenesis skjer på et senere tidspunkt etter DBS (dager 3-5) i dyremodeller ^1. I tillegg Encinas et al., Har rapportert hippocampus neurogenesis i voksen mus dentate gyrus etter høyfrekvent stimulering av ATN ^32. Tidligere studier ^33-35 har rapportert fallende hippocampus neurogenesis i visse epileptiske tilfeller som kronisk tinninglappen epilepsi og en tilknytning til lærings underskudd, svekket hukommelse og spontane tilbakevendende motoriske anfall. Videre var det en reduksjon i nervestamcelle progenitor faktorer som FGF2 og IGF-1 i kronisk epileptisk hippocampus i dyremodeller ^33. Vurderer dette, intervensjonsstrategier som DBS som viser en styrking av neurogenesis i dentate gyrus er spennende muligheter for forskning. Disse funnene har oppmuntret oss til å utforske videre dypt inn i mekanismen som ligger bak neurogenesis post-DBS behandling for epilepsi. Vi har målrettet ATN både ensidig (data ikke rapportert) samt bilateralt (i representative resultater) og sett forhøyet neurotrofin (BDNF) uttrykk i rotte dentate gyrus. Vår cjeldende hypotese er at BDNF uttrykk initierer en genuttrykk kaskade som kulminerer i neurogenesis som oversetter til antiepileptisk effekt av DBS kirurgi. I denne artikkelen presenterer vi våre metoder for DBS kirurgi rettet mot ATN hos rotter fulgt genekspresjonsanalyser med som en attraktiv tilnærming for å studere mekanismen bak fordelene med DBS.

Protocol

MERK: Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer diskutert i dette manuskriptet er i samsvar med NIH retningslinjer for Forsøksdyrutvalget (Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr) og er godkjent av Harvard Medical School IACUC komiteen. 1. Pre-kirurgisk Forberedelse Kontroller at alle kirurgiske instrumenter er sterilisert ved enten autoklave eller ved rensing med antiseptisk løsning og / eller etanol som nødvendig. Der det er mulig, bruker sterilt engangsutstyr som skalpeller, nål og …

Representative Results

Figurene 1A og 1B viser den relative ekspresjon av BDNF og GABRD i forhold til kontrollgenet β-aktin. BDNF, er et neurotrofin ofte forbundet med nevrobeskyttende effekter i mange nevronale sykdommer 38-41. Det er derfor interessant å analysere ekspresjonen profilen til BDNF i respons til stimulering av ATN som gir terapeutiske fordeler til epileptiske pasienter. I figur 1A, som viser genekspresjon profilen til BDNF på tvers av de indikerte tidspunktene leg…

Discussion

Etter landemerke arbeid av Benabid et al. I å bruke dyp hjernestimulering for å behandle Parkinsons sykdom og essensiell tremor, har DBS kirurgiske teknikken blitt undersøkt med mye interesse det siste tiåret til å behandle mange nevrologiske lidelser ^6,10,43. DBS-studier rettet mot forskjellige nevro-anatomiske regioner av hjernen kretsene er for tiden utført av mange grupper for å løse viktige neuronale sykdommer, og er i forskjellige faser av kliniske forsøk. Stimulering av subthalamic kj…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500