Summary
Этот протокол описывает простой и полезный метод для хранения периферической крови и сыворотки/плазмы для вниз по течению анализы единичных нуклеотидных Однонуклеотидный полиморфизм оценки и анализа ELISA.
Abstract
Качество образца крови имеет решающее значение для обеспечения точной течению анализы как реальном масштабе времени PCR или ELISA. Правильное хранение биологических материалов является отправной точкой для достижения надежных и воспроизводимых результатов. Все образцы должны рассматриваться таким же образом от крови коллекции для хранения. В зависимости от выполняемых анализов цельной крови и сыворотки образцы должны храниться при-20 ° C или ° C-80 до использования. В образцах сыворотки крови также должно быть aliquoted, чтобы избежать нескольких замораживания оттаивания. Еще одним важным вопросом является пример условий во время транспортировки из одной лаборатории в другую. Если сухой лед не доступен или отгрузки занимает больше времени, чем несколько дней, необходимы альтернативные подходы. Один из вариантов заключается в использовании фильтр бумага для сбора крови. Здесь мы предлагаем метод для крови и проб сыворотки, которая использует высушенные мазки крови (DBS) и сушат пятна сыворотки (DSS). Мы разработали процедуры для извлечения ДНК из DBS течению оценки некоторых единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП), ПЦР в реальном времени. Мы также оптимизировали пробирного ELISA, начиная от белков этого eluted от DSS. Этот метод может использоваться с другими ELISA assays или процедур оценки белков.
Introduction
Основная цель исследования в биомаркеров рака является выявление новых биологических параметров, которые могут использоваться для диагностики, прогнозирования прогноз пациента и для определения, будет ли отвечать на конкретные лечения пациента. Эта область исследований является основополагающим для открытия инновационных рака и играет ключевую роль в заказ лечения.
Процедуры, проведенных во время каждого шага биомаркер идентификации и проверки должны быть надежных и воспроизводимых. Краеугольным камнем успеха трансляционного исследования является правильным хранением биологических образцов крови и сыворотки. Это первый шаг на пути получения высокого качества биологический материал, который может использоваться для выполнения экспериментов молекулярной биологии или анализы белка.
Многоцентровых исследований часто необходимо набрать достаточное количество пациентов для получения надежных данных. Не все институты способны хранить образцы на-80 ° C или отправить образцы в других международных центров в сухой лед. Использование фильтра бумаги для сбора крови представляет собой простой метод для хранения крови и сыворотки и не требуется немедленное замораживание образцов1,2. Капля крови или сыворотки может быть выставлен на бумаге, оставить для высыхания на ночь и затем сохраняется на срок до 14 дней при комнатной температуре1,2. Это дает исследователям время направить образцы в других лабораториях. Использование засохшей крови пятна (DBS) и сушеная сыворотка пятна (DSS) может таким образом упростить сотрудничество между институтами в развитых и развивающихся странах.
Учитывая его простоту использования, DBS выборки широко используется в нескольких видов анализов для серологических или генетических анализов вниз по течению. Например в прошлом, DBS часто используются для скрининга в развивающихся странах1,2,3,,45ВИЧ. Еще одним преимуществом данного метода хранения является, что образцы крови могут быть собраны из пальца уколов, что позволяет использовать его для новорожденных, скрининг тесты 6,,78. Простой пример обработки и транспортировки являются дополнительные преимущества DBS, особенно для образцов, собранных в удаленных сайтах там, где нет лабораторное оборудование. В предыдущей публикации мы использовали DBS и DSS для тестирования витамина D и белок, связывающий витамина D (БРФ) в серии Кавказского региона и Африки пациентов9. Наши африканские коллеги не смогли получить сухой лед. Чтобы сравнить биологических маркеров, чтобы понять различия в витамин D пути между двумя этническими народностями, мы усовершенствовать процедуру, с помощью образцов хранятся в стандартных условиях и на фильтровальной бумаге. После оптимизации процедуры DBS/DSS, мы смогли проанализировать DBP и витамина D в сыворотке пациента в обеих когортах. Мы также оценили количество единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) после экстракции ДНК из цельной крови для кавказцев и DBS для африканцев9. Настоящий Протокол позволяет высокое качество образцов крови должны храниться при комнатной температуре, не затрагивая различные типы течению анализов, начиная от молекулярной биологии ELISA assays. Рекомендуется для использования для управления биологическими материалами в многоцентровых исследованиях или для центров, которые не имеют возможностей для хранения стандартных условий. Следующий протокол представляет собой кульминацию этих оптимизации процедур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Периферической крови и сыворотки были собраны и хранятся у здоровых доноров и пациентов, кто дал письменного информированного согласия на участие в исследовании. Протокол исследования был одобрен местной Комитет по этике в соответствии с этическим нормам, установленным в Хельсинкской декларации 1964.
1. кровь хранения в БД
-
Коллекция образцов крови
- Соберите 3 мл периферической крови в 3 мл с 5,4 мг Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
Примечание: Магазин периферической крови как DBS как можно скорее и в течение 8 ч. - Напишите номер пациента кода на нижнем правом углу карты заставка.
- Тщательно Ресуспензируйте крови с 5 мл пипетки.
- Соберите 3 мл периферической крови в 3 мл с 5,4 мг Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
-
Кровь, пятнистость на DBS
- Пипетка и передачи одно место с наконечником 50 – 200 мкл крови (50 мкл) на карточку заставка (Таблица материалов).
- Повторите шаг 1.2.1. иметь в общей сложности 3 – 5 пятна крови. Отменить старый кончик и принять новое одно для каждого крови аликвота.
- Оставьте DBS для высыхания на ночь при комнатной температуре в горизонтальном положении на открытой поверхности-абсорбент, избегая прямых солнечных лучей. Не закрывайте крышку заставка карты, для облегчения сушки крови.
Примечание: Любые частицы в воздухе или пыли во время сушки этот шаг не влияет на нисходящие приложения. - Храните карту при комнатной температуре в пластиковый пакет с осушителем до использования.
2. ДНК добыча, начиная с DBS согласно таблицы Kit экстракции ДНК (раздел для пятна засохшей крови)
-
Подготовка образца
- Используйте 3 сухие пятна крови с карты. Cut каждый из засохшей крови пятна от карты и отделить их от карты с помощью пинцета. Вырежьте пятна разлученных засохшей крови на мелкие кусочки (диаметр около 1 мм).
- Поместите кусочки в пластиковых пробирок 1.5 мл.
-
Образец пищеварение
- 180 мкл буфера lysis 1 комплекта (Таблица материалов) на трубу. 20 мкл протеиназы K. Не следует смешивать литического буфера 1 с протеиназы k до дозирование в 1,5 мл пробирку с кровью пятнистый карты. Смешайте vortexing.
- Трубка в thermoincubator и Инкубируйте на 56 ° C 60 мин. Если thermoincubator не оборудован шейкер, вихревой образец каждые 10 – 15 минут для по крайней мере 10 s, заботясь не пускать температура образца уменьшаться. Кратко центрифуга трубы для удаления капли из крышки.
-
Вымойте шаг
- Добавить 200 мкл буфера lysis 2 (Таблица материалов) и вихревые для 10 s.
- Место труб в thermomixer или подогревом орбитальных инкубатора и Инкубируйте на 70 ° C на 10 мин. Если thermoincubator не оборудовано шейкер, вихревой образцы один раз для по крайней мере 10 s, заботясь не пускать температуры образцов уменьшаться.
- Повторите шаг 2.3.1. Передача 400 мкл lysate от 1,5 мл трубки элюции столбец (Таблица материалов). Центрифуга для столбца на 6000 x г за 1 мин.
- Поместите столбце элюции в новой коллекции 2-мл пробирку и удалить старый.
- Добавьте 500 мкл буфера мытья 1 (Таблица материалов) и центрифуги на 6000 x г за 1 мин.
- Вставьте столбец в новой коллекции 2-мл пробирку и удалить старый.
- Добавьте 500 мкл буфера мытья 2 (Таблица материалов) и центрифуги на 6000 x г за 1 мин.
- Вставьте столбец в новой коллекции 2-мл пробирку и удалить старый.
- Центрифуга на 20000 x g 3 мин для просушки мембраны.
-
Элюирующий шаг
- Вставьте столбец в новых пластиковых пробирок 1.5 мл и отбросить коллекции трубки.
- Место 50 мкл дистиллированной воды на центре мембраны. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга трубки на 20000 x g за 1 мин сбор элюата и снова поместите ее на центре мембраны.
- Центрифуга трубки на 20000 x g за 1 мин отбросить мембраны.
- Измерение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра.
- ДНК в магазине при-20 ° C до использования.
Примечание: ДНК, извлеченные из БД может использоваться для выполнения несколько анализов, например SNP оценки в реальном масштабе времени PCR или ДНК Сэнгер последовательности.
3. сыворотка хранения для DSS
-
Коллекция образцов крови
- Соберите 7 мл периферической крови в 7 мл без ЭДТА. Оставьте образец крови для коагуляции на 30 минут при комнатной температуре.
- Напишите номер пациента кода на нижнем правом углу карты заставка.
- Центрифугуйте образцы крови в 980 x g 15 мин при комнатной температуре.
Примечание: Хранить сыворотки, как DSS как можно скорее и в течение 8 ч. - Тщательно удалить супернатант из трубки и перенести его на новой трубки 15 мл. Тщательно Ресуспензируйте крови с 5 мл пипетки.
-
Сыворотка, кровянистые выделения в DSS
- Пипетка и передачи одно место сыворотки (50 мкл) на карточку заставка. Повторите этот шаг, чтобы иметь в общей сложности 3 – 5 пятна крови.
Примечание: Будьте очень осторожны с Пипетка ровно 50 мкл сыворотки в каждом месте. Сыворотка не должен выходить за рамки от пунктирной линии карты. - DSS оставьте для высыхания на ночь при комнатной температуре. Не закрывайте крышку заставка карты, для облегчения сушки крови.
- Храните карту при комнатной температуре в пластиковый пакет с осушителем до использования. Если хранилище превышает 14 дней, храните карту при-20 ° C.
- Пипетка и передачи одно место сыворотки (50 мкл) на карточку заставка. Повторите этот шаг, чтобы иметь в общей сложности 3 – 5 пятна крови.
4. ELISA Assay начиная с DSS
-
Элюировать белка из DSS.
- При необходимости, оттепель DSS для каждого образца. DSS мелко нарежьте (около 1 мм в диаметре). Собрать в 1,5 мл трубку с 400 мкл PBS.
- Встряхнуть образцы на ночь при 4 ° C.
Примечание: Shake их при низкой интенсивности. PBS не следует Намочите крышку трубки во время встряхивания.
- Используйте белка элюата как образец сыворотки для секретируемые белки/роста факторного анализа по ELISA комплект инструкции, после соответствующих разведений.
Примечание: Эта процедура хорошо работает для обнаружения DBP9. Для других assays ELISA шаг оптимизации могут быть необходимы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы воспользовались DBS и DSS процедур для хранения крови и сыворотки при комнатной температуре без ущерба для качества биологического материала. На рисунке 1 показан пример белка карты заставки без крови и после сбора крови. Для того, чтобы подтвердить, что хранения на фильтровальной бумаге и процедура элюировать крови не мешают образец качества, мы провели сравнение с методами стандартных хранения. Мы извлекли ДНК из 3 образцов цельной крови, собранные в 2-мл пробирку или хранится в БД, как сообщалось в разделе протокол. Были проанализированы пять SNPs ПЦР в реальном времени. Данные, полученные для образцов были 100% совпадают.
Что касается анализа ELISA, мы хранится 8 проб сыворотки, собранных в 2-мл пробирку (и сразу же температуре-80 ° C) и как DSS (хранится при комнатной температуре в течение одной недели и затем при-20 ° C). Мы этого eluted белки от DSS, как описано в разделе протокол, а затем выступила ELISA согласно таблицы производителя DBP для 8 образцов. Результаты приведены в таблице 1. Коэффициент вариации (кв) между образцов колебалась от 2% до 24%. Среднее резюме был 9,6%.
Рисунок 1: пример DBS до и после взятия крови. (A) белка заставка карты. (B) белка заставка карты после забора крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| DBP (мкг/мл) | |||
| Образцы | Сыворотка (st) | DSS | ООПС |
| 1 | 66.47 | 65,28 | 2 |
| 2 | 213,31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
Таблица 1: уровни РОП в образцах сыворотки и соответствием DSS. DBP уровни анализируемой анализа ELISA. CV-это коэффициент вариации, рассчитанное в интервале между 2 полученных значений. CV процент рассчитывается следующим образом: значение ((DSS value-Serum value)/DSS) х 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол исследует потенциал для хранения крови и сыворотки на фильтровальной бумаге, когда лаборатории не имеют сотрудников или инфраструктуры, необходимой для правильной обработки образцов крови. В частности цельной крови или сыворотки, собранных в стандартных труб или палец укол могут храниться с помощью этого метода, и нет необходимости блокировать образцов при-20 ° C или ° C-80 сразу после забора крови. DBS/DSS может оставаться при комнатной температуре до 14 дней без каких-либо изменений в сыворотке крови целостности. Важным вопросом для хранения является наличие влаги, которая влияет на свойства биологического материала более чем температура. Этой проблемы можно избежать, используя пластиковые мешки с осушителем. Влага становится проблемой во время хранения, когда карты находятся внутри пластиковые мешки. Проблемы, связанные с твердыми в воздух/капли/пыли и влаги не наблюдалось в течение ночи инкубации10. Ранее мы использовали фильтр бумага для хранения крови и сыворотки в исследовании биологических маркеров в Италии и африканских когорты11. Мы оптимизирована экстракции ДНК из БД и анализируется ряд ОНП в обоих случая серии. Как мы были заинтересованы в оценке уровня белка, мы оптимизировали способ элюировать белки от DSS для выполнения ELISA assays. Хранение сыворотки в DSS для ELISA более тонкий, чем цельной крови хранения для качественного анализа, потому что лаборатории исследователи должны быть обязательно Пипетка точно такое же количество сыворотки во всех образцах. Если закупорить не является точной, ниже по течению анализы будут скомпрометированы. Хотя процедура извлечения ДНК может применяться к другим молекулярного анализа, белок процедуры должны быть оптимизированы в образцов для каждого нового цитокина/выделяется фактор расследование. Важно, чтобы очень мелко нарезать DSS и для мокрой части карты тщательно с PBS в течение ночи инкубации для обеспечения эффективного белков элюции. Это более тонкий шаг чем элюции крови, потому что ELISA является дать количественную оценку.
В последние годы этот подход хранения широко используется для различных приложений, от молекулярной биологии (как описано в настоящем протоколе) до белка анализа12,13. В частности хорошее качество, были массовые результаты, начиная от сыворотки, заметили в хранитель карт сообщил14, подтверждающие высокую гибкость и надежность метода.
Наши результаты, по согласованию с литературой, подчеркнуть полезность хранить образцы как DBS и подтвердить достоверность этой процедуры в отношении методов стандартных хранения. Мы подтвердили предыдущие результаты и подчеркнули возможность оптимизации ELISA assay, используя его совместно с наши методы хранения. Благодаря своей простоте развивающиеся страны могут также способствовать исследований рака. К примеру как большинство исследований на африканцев выполняются на афро-американцев, очень мало данных доступны на родной африканцев9. Использование DBS могут помочь восполнить этот пробел.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Грайне Тирни для редакционной помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
