Summary
Bu iletişim kuralı periferik kan ve serum/plazma tek nükleotit polimorfizmi (SNP) değerlendirme ve ELISA tahlil gibi aşağı akım analizleri için saklamak için basit ve kullanışlı bir yöntem açıklanır.
Abstract
Kan örnek kalite gerçek zamanlı PCR veya ELISA gibi doğru aşağı akım analizleri sağlamak çok önemlidir. Biyolojik malzeme doğru depolama tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar elde etmek için başlangıç noktasıdır. Tüm örneklerini aynı şekilde depolama birimine kan koleksiyonundan değerlendirilmelidir. Analizler yapılması için bağlı olarak, tam kan ve serum numuneleri-20 ° C veya-80 ° C kadar kullanmak saklanmalıdır. Kan/serum numuneleri de birden çok donma-çözülme önlemek için bölünmemeli olmalıdır. Bir başka önemli konu bir laboratuvar Sevikiyatta başka bir örnek koşullar bulunuyor. Kuru buz kullanılamaz veya sevk irsaliyesi birkaç günden daha uzun sürer, alternatif yaklaşımlar ihtiyaç vardır. Filtre kağıdı kan toplanması için kullanılmasını bir seçenektir. Burada, bir yöntem kan için önerdiğimiz ve yararlanır serum örnek toplama kan lekeleri (DBS) kurutulmuş ve serum noktalar (DSS) kurutulmuş. Biz DNA DBS bazı tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) aşağı akım değerlendirme için gerçek zamanlı PCR ayıklamak için prosedür geliştirilmiştir. Biz de DSS eluted proteinler başlayarak bir ELISA tahlil optimize. Bu yöntem diğer ELISA testleri veya yordamlar proteinler değerlendirilmesi ile kullanılabilir.
Introduction
Araştırmanın temel amacı kanser biyolojik içine tanı, predicting hasta prognoz ve bir hasta belirli bir tedaviye yanıt olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir yeni biyolojik parametreler tanımlamasıdır. Bu araştırma alanı yenilikçi kanser tedavileri keşfi için temel ve özel tedavisinde önemli bir rol oynar.
Her adımında biyomarker tanımlama ve doğrulama sırasında yürütülen yordamlar güvenilir ve tekrarlanabilir olmalıdır. Kan ve serum gibi biyolojik örneklerin doğru depolama translasyonel araştırma başarısı için bir taşıdır. Moleküler biyoloji deneyleri veya protein testleri gerçekleştirmek için kullanılan yüksek kaliteli biyolojik malzeme elde etme yolunda ilk adım bu.
Kadınlarında çalışmalar kez sağlam veri elde etmek için yeterli hasta işe almak için ihtiyaç vardır. Tüm kurumları örnekleri-80 ° C'de veya kuru buz içinde uluslararası diğer merkezlere örnekler göndermek için edebiliyoruz. Filtre kağıdı kullanımı kan koleksiyonu için kan ve serum depolamak için basit bir yöntemdir ve örnekleri1,2hemen dondurulması gerektirmez. Bir damla kan veya serum kuru gecede yaptı ve sonra 14 gün oda sıcaklığında1,2için depolanan kağıt üzerine lekeli olabilir. Bu araştırmacılar örnekleri diğer laboratuvarlar için göndermek için zaman verir. Kurumuş kan kullanımı (DBS) noktalar ve kurutulmuş serum noktalar (DSS) böylece gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde kurumları arasındaki işbirliğini kolaylaştırmak.
Kullanım kolaylığı göz önüne alındığında, DBS örnekleme yaygın serolojik veya genetik aşağı akım analizleri için çeşitli deneyleri içinde kullanılır. Örneğin, geçmişte, DBS sık gelişmekte olan ülkelerde1,2,3,4,5' te eleme HIV için kullanılmıştır. Bu depolama yöntemi bir diğer avantajı kan örnekleri parmak-pislikler, böylece tarama testleri 6,7,8yenidoğan için kullanımı etkinleştirilmesi toplanan olduğunu. Kolay örnek kullanım ve taşıma vardır daha fazla DBS, avantajları özellikle uzak sitelerdeki toplanan örnekleri için olduğu yerde yok Labaratuar donanımları. Bir önceki yayın biz DBS ve DSS D vitamini ve D vitamini bağlayıcı protein (DBP) beyaz ve Afrika hastaların9bir dizi sınamak için kullanılır. Afrikalı meslektaşlarımıza Kuru buz elde etmek mümkün değildi. D vitamini yolu iki etnik nüfus arasındaki farklılıkları anlamak için biyolojik veri işaretleyicilerini karşılaştırmak için daha fazla eşleşen örnekler standart koşullar altında ve filtre kağıdı depolanmış yordam geliştirilmiş. DBS/DSS yordamı optimize sonra biz DBP ve her iki tabur hasta serumda D vitamini çözümlemek başardık. Biz de DNA ekstraksiyon işgal için tam kan ve DBS Afrikalılar9dan sonra bir dizi tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) değerlendirildi. Mevcut Protokolü kaliteli kan örnekleri karşıdan akış analizleri moleküler biyoloji ELISA deneyleri için arasında değişen farklı türde etkilemeden oda sıcaklığında saklanmasına izin verir. Bu Biyolojik materyallerde kadınlarında çalışmalarda yönetmek kullanmak veya standart depolama koşulları için imkanlar var mı merkezleri için tavsiye edilir. Aşağıdaki iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş bu yordamları doruk temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Periferik kan ve serum toplanan ve sağlıklı bağış ve Yazılı onam çalışmaya katılmak için veren hastalar depolanır. Çalışma protokolü 1964 Helsinki Bildirgesi içinde ortaya konan etik standartlarına uygun olarak Yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. kan depolama DBS
-
Kan örneği koleksiyonu
- Periferik kan örneği 3 mL tüp içinde 3 mL ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 5.4 mg ile toplamak.
Not: periferik kan olarak en kısa zamanda DBS ve 8 h içinde saklayın. - Hasta kod numarası koruyucu kartı alt sağ köşede yazmak.
- Dikkatle 5 mL pipet ile kan resuspend.
- Periferik kan örneği 3 mL tüp içinde 3 mL ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 5.4 mg ile toplamak.
-
DBS üzerinde lekelenme kan
- Pipet ve kan (50 µL) (Tablo reçetesi) koruyucu kartına bir yerde 50-200 µL bahşiş ile aktarın.
- 1.2.1 arasındaki adımları yineleyin. 3-5 kan noktalar toplamda sahip olmak. Yaşlı uç atın ve her kan için yeni bir aliquot alın.
- DBS bir yatay pozisyonda oda sıcaklığında kuru gecede doğrudan güneş ışığından kaçınmak bir açık emici olmayan yüzey üzerinde bırakın. Koruyucu kartı kapağını kan kurutma kolaylaştırmak için açık bırakın.
Not: Herhangi bir partikül hava veya toz kurutma bu adımı sırasında aşağı akım uygulamaları etkilemez. - Kartı oda sıcaklığında nem ile bir plastik torba kullanmak kadar saklamak.
2. DBS DNA ekstraksiyon kiti veri sayfası (kurumuş kan lekeleri için bölümüne) göre başlayarak DNA ekstraksiyon
-
Numune hazırlama
- 3 kurumuş kan lekeleri kartı kullanın. Her kart kurumuş kan noktalardan biri kesmek veya cımbız ile kartından ayırabilirsiniz. Ayrılmış kurumuş kan lekeleri (çapı 1 mm) küçük parçalar halinde kesin.
- Küçük bir 1,5 mL santrifüj tüpüne alin.
-
Örnek sindirim
- 180 µL lizis tampon tüp seti (Tablo reçetesi) sağlanan 1 ekleyin. 20 µL İndinavir K. Ekle Lizis arabellek 1 1,5 mL tüp içine kart benekli kanla pipetting önce İndinavir k ile birlikte kullanmayın. Vortexing tarafından mix.
- Bir thermoincubator tüpü yerleştirin ve 60 dk 56 ° C'de kuluçkaya. Thermoincubator girdap örnek bir shaker ile donatılmış değil eğer en azından 10 için her 10-15 dk s, örnek sıcaklığını azaltmak izin vermemeye dikkat çekici. Kısaca damla--dan kapağı kaldırmak için tüpler santrifüj kapasitesi.
-
Yıkama adım
- 200 µL lizis arabelleğinin 2 (Malzemeler tablo) ve 10 için girdap ekleyin s.
- Bir thermomixer veya ısıtmalı yörünge kuluçka tüpler yerleştirin ve 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya. Eğer thermoincubator bir shaker ile donatılmış değil girdap örnekleri bir kez için en az 10 s, örnekleri sıcaklığını azaltmak izin vermemeye dikkat çekici.
- 2.3.1 arasındaki adımları yineleyin. Transfer, lysate 400 µL 1,5 mL tüp elüsyon sütun (Malzemeler tablo). 6.000 x g 1 dk. için adresindeki sütun santrifüj kapasitesi.
- Elüsyon sütun yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin ve eski bir atın.
- 500 µL yıkama arabelleği 1 (Malzemeler tablo) ve santrifüj 6.000 x g 1 dk. için ekleyin.
- Sütun yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin ve eski bir atın.
- 500 µL yıkama arabelleğinin 2 (Malzemeler tablo) ve santrifüj 6.000 x g 1 dk. için ekleyin.
- Sütun yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin ve eski bir atın.
- Membran kuru için 3 dakika için 20.000 x g, santrifüj kapasitesi.
-
Elüsyon adım
- Sütun yeni 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve toplama tüp atın.
- Yer 50 µL distile su membran ortasına üzerine. Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- 20.000 x g 1 dk. toplamak, tüp eluate santrifüj kapasitesi ve tekrar membran ortasına yerleştirin.
- 1 dakika süreyle santrifüj tüpü 20.000 x g de zar atmak.
- Bir spektrofotometre kullanarak DNA toplama ölçmek.
- Mağaza DNA-20 ° c kadar kullan.
Not: DBS çıkarılan DNA SNP değerlendirme gibi birçok analizleri gerçekleştirmek için gerçek zamanlı PCR veya DNA Sanger sıralama tarafından kullanılabilir.
3. serum depolama DSS için
-
Kan örneği koleksiyonu
- 7 mL EDTA olmadan 7 mL tüp periferik kan örneğinde toplamak. Oda sıcaklığında 30 dakika koagüle kan örneği bırakın.
- Hasta kod numarası koruyucu kartı alt sağ köşede yazmak.
- Kan örneği ' 980 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi.
Not: serum olarak en kısa zamanda DSS ve 8 h içinde saklayın. - Dikkatle ve yeni bir 15 mL tüp transfer süpernatant tüpünden çıkarın. Dikkatle 5 mL pipet ile kan resuspend.
-
DSS içinde lekelenme serum
- Pipet ve tek bir noktada serum (50 µL) koruyucu kartına aktarmak. 3-5 kan lekeleri bakildi için bu adımı yineleyin.
Not: tam olarak 50 µL serum her yerini pipet için dikkatli olun. Serum ötesinde kart kesikli çizgi gitmemeli. - DSS oda sıcaklığında kuru gecede bırakın. Koruyucu kartı kapağını kan kurutma kolaylaştırmak için açık bırakın.
- Kartı oda sıcaklığında nem ile bir plastik torba kullanmak kadar saklamak. Depolama 14 günden daha uzun olursa, kart-20 ° C'de depolayın
- Pipet ve tek bir noktada serum (50 µL) koruyucu kartına aktarmak. 3-5 kan lekeleri bakildi için bu adımı yineleyin.
4. ELISA Assay DSS başlayarak
-
DSS protein elute.
- Gerekirse, her örnek için bir DSS çözülme. DSS (yaklaşık 1 mm çapında) küçük parçalara kesilmiş. Adet 400 µL PBS ile 1,5 mL tüp içine koyun.
- Örnekleri gecede 4 ° C'de sallamak
Not: onları düşük yoğunlukta sallamak. PBS tüp kapak sallayarak sırasında ıslak değil.
- Protein eluate serum örneği salgılanan protein/büyüme faktör analizine göre ELISA kiti talimatları, sonra uygun dilutions kullanın.
Not: Bu yordam de DBP algılama9için çalışır. Diğer ELISA deneyleri için bir en iyi duruma getirme adım gerekli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyolojik malzeme kalitesini etkilemeden kan ve serum oda sıcaklığında saklamak için DBS ve DSS yordamlar yararlandı. Şekil 1 protein kart koruyucu olmadan kan ve kan toplama sonra bir örneği gösterilir. Filtre kağıdı üzerindeki depolama ve kan elute yordamına örnek kalite ile karışmayın onaylamak için biz standart depolama yöntemleri ile bir karşılaştırma yapılacak. Biz DNA tam bir 2 mL tüp içinde toplanan veya DBS depolanan kan 3 eşleşen örnekleri olarak Protokolü bölümünde rapor elde. Beş SNPs gerçek zamanlı PCR tarafından analiz edildi. Eşleşen örnekleri için elde edilen veriler %100 uyumlu idi.
ELISA analizleri, ile ilgili olarak biz 8 serum 2 mL tüp içinde toplanan örnekleri saklanır (ve hemen-80 ° C'de depolanan) ve DSS (bir hafta için oda sıcaklığında ve sonra-20 ° C'de depolanan) olarak. Biz Protokolü bölümünde açıklandığı gibi proteinler DSS, üzerinden eluted ve sonra ELISA için 8 örnekleri DBP için üretici veri sayfası göre gerçekleştirilen. Sonuçları Tablo 1' de gösterilmiştir. Eşleşen örnek % 2 den % 24 değişmekteydi arasında (CV) varyasyon katsayısı. Ortalama CV % 9,6 yapıldı.
Şekil 1: DBS öncesi ve sonrası kan toplama örneği. (A)Protein koruyucu kartı. (B) Protein koruyucu kartı kan örnekleme sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| DBP (µg/mL) | |||
| Örnekleri | Serum (st) | DSS | MF % |
| 1 | 66.47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
Tablo 1: DPB seviyeleri eşleşen DSS ve serum numuneleri. ELISA tahlil tarafından analiz DBP düzeyleri. CV 2 elde edilen değerler arasında hesaplanan varyasyon katsayısı olduğunu. CV yüzdesi aşağıdaki gibi hesaplanır: ((DSS value-Serum value)/DSS değeri) x %100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı laboratuarlar personel ya da kan örnekleri doğru kullanımı için gerekli altyapı var mı ne zaman kan ve serum filtre kağıt üzerinde depolamak için potansiyel inceler. Özellikle, tam kan veya serum standart tüpler veya parmak-hıyar tarafından toplanan bu yöntem kullanılarak depolanabilir ve hemen sonra kan toplama örnekleri-20 ° C veya-80 ° C dondurmak için gerek yoktur. DBS/DSS oda sıcaklığında kan/serum bütünlük içinde herhangi bir değişiklik olmaksızın 14 güne kadar kalabilir. Depolama birimi için kritik bir konu biyolojik malzeme daha fazla sıcaklık özelliklerini etkileyen nem varlığıdır. Bu sorun kurutucu ile plastik torbalar kullanarak önlenebilir. Zaman kartları plastik torbalar içinde nem depolama sırasında bir sorun olur. Partikül Hava/damlacıkları/toz veya nem kaynaklanan sorunları sırasında gece kuluçka10gözlenen değil. Daha önce İtalyan ve Afrika tabur11biyolojik işaretlerinin bir çalışmada kan ve serum depolamak için filtre kağıdı kullanılır. Biz DNA çekme--dan DBS en iyi duruma getirilmiş ve SNPs bir dizi her iki durum serisi yılında analiz. Biz de protein düzeyleri değerlendirilmesinde ilgilenmişlerdir olarak proteinler DSS üzerinden ELISA testleri gerçekleştirmek için elute için bir yöntemi optimize. Laboratuar araştırmacılar tüm örneklerinde serum tam olarak aynı miktarda pipette emin olması gerektiğinden DSS ELISA için serum depoda daha tam kan depolama kalitatif analiz için daha hassas olduğunu. Pipetting doğru değilse, aşağı akım analizleri tehlikeye girer. DNA ekstraksiyon yordam diğer moleküler analizleri için uygulanabilir iken, protein yordam eşleşen örnekleri her yeni sitokin/salgılanan faktör araştırmış için optimize edilmelidir. DSS çok küçük parçalar halinde kesin ve etkili protein elüsyon emin olmak için gece kuluçka sırasında kartı PBS ile iyice adet ıslak önemlidir. ELISA nicel bir değerlendirme olduğundan bu kan elüsyon daha hassas bir adımdır.
Son yıllarda, bu depolama yaklaşım yaygın (Bu protokol için açıklandığı gibi) moleküler biyoloji için protein analizi12,13arasında değişen farklı uygulamalar için kullanılmıştır. Özellikle, kaliteli toplu sonuçlar koruyucu kartlarda benekli serum başlayarak14yüksek esneklik ve güvenilirlik-in belgili tanımlık yöntem onaylayan, bildirdi.
Sonuçlarımız literatür ile anlaşma örnekleri DBS saklama yararı vurgulayın ve standart depolama yöntemleri ile ilgili olarak bu yordamı güvenilirliğini onaylamak. Biz önceki sonuçları teyit ve bizim depolama yöntemleri ile birlikte kullanarak bir ELISA yöntemi en iyi duruma getirme olasılığı altını çizdi. Sadeliği sayesinde, gelişmekte olan ülkelerde de kanser araştırmaları için katkıda bulunabilir. Örneğin, Afrikalılar üzerinde çalışmalar çoğunluğu Afrikalı Amerikalılar üzerinde gerçekleştirilen gibi çok az veri yerel Afrikalılar9üzerinde kullanılabilir. DBS kullanılması bu boşluğu için yardımcı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Gráinne Tierney Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
