Summary
Здесь мы представляем протокол для иммунофлуоресценции окрашивания наблюдать эндотелиальных клеток аорты мыши непосредственно. Этот метод полезен при изучении клеточного и молекулярного фенотипа эндотелиальных клеток в различных структурах потока и в развитии атеросклероза.
Abstract
Аномальные изменения в эндотелиальном фенотипе и морфологии считаются первоначальными событиями при патогенезае атеросклероза. Прямое наблюдение за нетронутым инее эндотелием даст ценную информацию для понимания клеточных и молекулярных событий в дисфункциональных эндотелиальных клетках. Здесь мы описываем модифицированную технику окрашивания иммунофлуоресценции en face, которая позволяет ученым получить четкие изображения нетронутой эндотелиальной поверхности и проанализировать модели экспрессии молекул на месте. Метод прост и надежен для наблюдения за всем эндотелиальным монослойом на разных участках аорты. Этот метод может быть перспективным инструментом для понимания патофизиологии атеросклероза, особенно на ранней стадии.
Introduction
Ранние изменения в сосуде в первую очередь инициируются в эндотелии, который функционирует как селективный барьер между кровью и стенкой сосуда с ее межклеточными узкими стыковочными комплексами1. Существенные данные указывают на важную роль для механических эффектов кровотока в модуляции эндотелиальной функции2. Напряжение сдвига жидкости, фрикционная сила, порожденная кровотоком, дифференциально формы эндотелиальной морфологии клеток и функции, в зависимости от конкретных парадигм потока в различных сосудистых участках2,3. Атеросклеротические поражения преимущественно происходят в местах нарушения кровотока (d-потока), таких как кривизны сосудов, разделители потока и ветви точек, по сравнению с регионами постоянного потока (s-flow), такими как прямой сегмент артерии. Таким образом, прямое наблюдение эндотелиальной морфологии и моделей молекулярной экспрессии должно обеспечить важное понимание структурных и функциональных фенотипов эндотелиальных клеток при различных парадигмах потока.
Культурные эндотелиальные клетки не могут выразить фактический фенотип, как они делают in vivo отчасти из-за потери воздействия жидкости сдвига стресс, окружающие цитокинов, и клеток или клеток экстраклеточной матрицы взаимодействий. Чтобы помочь этому, нетронутый эндотелиальный монослой клеток может быть изучен на поперечных участках с использованием классической иммуногистохимии. Однако эндотелиальный монослой настолько тонкий и хрупкий, что его обычно не удается четко наблюдать. Эн лицо иммуногистохимии был использован для наблюдения за внутренней поверхности эндотелия, но является либо сложным или неустойчивым в его результатах, потому что эндотелий легко раздели из основной ткани, или только часть артериальной стенки крыс или кроликов, чьи стены толстые, установлен оснащается4,5.
Мышимодели имеют значительные преимущества перед другими животными во многих отношениях. Здесь мы используем модифицированный метод иммунофлуоресценции для анализа эндотелиальных клеток аортальной арки и грудной аорты в мыши C57BL/6. Такая методика широко используется для изучения эндотелиальной патофизиологии в различных структурах потока и в развитииатеросклероза 6,7,8,9,10. Этот метод позволяет ученым четко наблюдать за всей поверхностью эндотелия и сравнивать экспрессионные модели данного белка в регионах под различными сдвигами жидкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с экспериментальными протоколами, утвержденными Комитетом по ресурсам животных Шанхайского университета Цзяо Тонг.
1. Перфузия аорты мыши
- Кратко, анестезируйте 12-недельных мышей C57BL/6 с интраперитонеальными инъекциями пентобарбитала натрия (50 мг/кг массы тела). Подтвердите правильное обезвреживание, мягко щипая хвост.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если движения не наблюдается, животное достаточно обезобезвистано, чтобы начать эксперименты. - Лента лапы мыши на стопку бумажных полотенец с клейкой ленты.
- Держите кожу мыши с щипками и вырезать кожу с ножницами от живота до верхней части грудной клетки.
- Откройте брюшную полость ниже грудной клетки острыми ножницами.
- Поднимите грудину щипками и разрежьте диафрагму; затем, отрезать грудную клетку, чтобы разоблачить грудной полости.
- Отрежьте поливу вены чуть выше печени, ножницами.
- Давление perfuse (100 мм рт. ст.) артериального дерева в течение 5 минут с прехлафтовой нормальной солевой, содержащей 40 единиц /мл гепарина через левый желудочек, пока легкие и печень не побледнеют. Затем, perfuse с прехиллированным 4% параформальдегида в фосфат-буферных солей (PBS, рН 7,4) в течение 3 мин.
- Удалите все мышцы, органы и жир, пока аорта подвергается.
- Поместите мышь под рассекающий микроскоп.
2. Рассечение и продольное открытие аорты
- Выставить аорту четко под рассекающим микроскопом и удалить соединительные ткани вдоль аорты как можно более чистыми, с тонкими щипками и парой тонких ножниц (Рисунок 1).
- Вскрыть грудной аорты от сердца до келья ствола с парой деликатных ножниц и положить аорты в 6 см клеточной культуры блюдо с PBS. Отрежьте открытые аорты продольно, вдоль меньшей кривой, и вдоль большей кривой, пока прямой сегмент не будет выполнен. Разрежьте три ветви аортированной арки, в том числе неноминец, левой общей сонной и левой подклавиаской артерии, с микросцинсорами, как показано на рисунке 2.
3. Предварительная обработка и иммуностоирование аорты
- Пермяки аорты с 0,1% полиоксиэтилен овтрил фенил эфир в PBS в течение 10 минут и блокировать его с 10% нормальной козьей сыворотки в Tris-буферный солен (TBS), содержащий 2,5% полисорбат 20 для 1 ч при комнатной температуре в 12-хорошей клеточной культуры пластины.
- Далее, инкубировать аорту с 5 г/ мл кролика анти-VCAM-1 и 5 г / мл крысы анти-VE-кадерин в блокирующем буфере, на ночь при 4 градусах Цельсия.
- После промывки образца 3x с мытьем раствора (TBS, содержащий 2,5% полисорбат 20), применять флуоресценции конъюгированных вторичных антител (1:1,000 разбавления, Alexa Fluor 555-помеченный анти-кролик IgG и Alexa Fluor 488-метка анти-крыса IgG) для 1 h Температура. Промыть 3x в стиральном растворе.
- Противостоит аорте с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (1 мкг/мл) в течение 10 минут и промыть его 3x в стиральном растворе.
4. Монтаж аорты на стеклянной горке
- Поместите аорту на крышку с поверхностью светила вниз и медленно переместите ее в раствор установки антифадейда, ранее сброшенного на крышку. Аккуратно растянуть аорту, чтобы сохранить образец плоским.
- Обратный крышкой и положить его на слайд стекла. Необходимо позаботиться о том, чтобы не допустить, чтобы между образцом и стеклом оставались пузырьки воздуха.
5. Наблюдение за аортой
- Изучите аорту с помощью конфокального микроскопа с лазерным сканированием.
- Анализ цветовых интенсивностей различных каналов из желаемой области в en face images с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
12-недельная мышь C57BL/6 была усыплена и проникнута нормальным сольным раствором, содержащим 40 единиц/мл гепарина, а затем прехиллированной 4% параформида. Мышь аорта была выставлена под рассекающим микроскопом(рисунок1), расчленена и разрезана продольно (рисунок2). En лицо иммунофлуоресценции окрашивание сосудистых эндотелиальных клеток было выполнено, как показано на рисунке 3 и таблице 1. En лицо иммунофлуоресценции сосудистых клеток стежка белка-1 (VCAM-1) выражение с VE-cadherin как эндотелиальный маркер был показан при различных моделей потока из разных областей аорты мыши. DAPI был также противопоказан, чтобы показать ядра клеток для лучшей визуализации. Эндотелиальные и гладкие мышечные клетки можно легко отличить от морфологии ядер клеток при взгляде через z-стеки под микроскопом, так как ядра эндотелиальных клеток имеют овальную форму и больше, чем шпиндель-образные гладкие ядра мышечных клеток. Репрезентативные изображения лица показаны на рисунке 4. Аорта была исследована LSM 710 Лазерное сканирование микроскопа(Таблица материалов) с FLUAR 40x/1,3 масляной линзы. С en лицо иммунофлуоресценции окрашивания, мы можем четко и непосредственно наблюдать, что выражение VCAM-1 был более обильным в регионах под нарушенным потоком (меньшее кривизны арки аорты), чем в тех, под устойчивый поток (большая кривизна арки аорты и торакальной аорты).
Рисунок 1 : Разоблачение мыши аорты под рассекающим микроскопом. Удалите соединительные ткани вдоль аорты как можно более чисто. а неназначенная артерия; б - левая общая сонная артерия; с левой подклавской артерией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Рассечение мыши грудной аорты и резки его открыть продольно. (A) торакальная аорта от сердца до целиакии ствол был разрезан вдоль меньшей кривой продольно, и вдоль большей кривой, пока прямой сегмент был встречен. Три ветви аортированной арки, включая неназначенную, оставили общую сонную артерию и левую подклавианскую артерию, также были разрезаны микроскисорами. Красные линии, раздавленные, указывают на режущей линию. (B) Аорта была открыта и распространение плашмя на стеклянные горки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Схема для ан лицо иммунофлуоресценции окрашивания сосудистых эндотелиальных клеток. Во-первых, permeabilize расчлененных аорты с 0,1% полиоксиэтилен овцил фенил эфир в PBS в течение 10 минут и блокировать его с 10% нормальной козьей сыворотки в TBS, содержащий 2,5% полисорбат 20 на 1 ч при комнатной температуре в 12-хорошо плиты культуры клеток. Далее, инкубировать аорту с первичным антителом в блокирующем буфере на ночь при 4 градусах Цельсия, и промойте его три раза с мытьем раствора (TBS, содержащий 2,5% полисорбат 20). Затем нанесите флуоресценцию-конъюгированные вторичные антитела на 1 ч при комнатной температуре и трижды промыть. Противостоит аорте с DAPI в течение 10 минут и промойте его три раза в стиральном растворе. Наконец, смонтировать аорту на стеклянной горке и наблюдать за аортой с помощью лазерного конфокального микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Представитель ан лицо окрашивания результатов. (A) En лицо иммунофлуоресценции анализа меньшей кривизны мыши аорты (d-поток области) и больше кривизны или грудной аорты (S-потока областях), чтобы сравнить эндотелиальной VCAM-1 выражение под различными парадигмами потока. Эндотелиальная морфология клеток показана VE-кадчериновым окрашиванием. (B) Представитель d-потока областях (меньшей кривизны) и s-потока областях (большая кривизна и грудной аорты) указываются стрелки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Шаг | Процесс | Буфера | Температура | Время |
| 1 | Пермяки | 0,1% полиоксиэтилен овцил фенил эфир в PBS | Температура в комнате | 10 мин. |
| 2 | Блокировки | 10% нормальная козья сыворотка в трис-буферизированный солен (TBS), содержащий 2,5% полисорбат 20 | Температура в комнате | 1 ч |
| 3 | Первые антитела (5 г/мл) | Блокирующий буфер | 4 кк с | Ночь |
| 4 | Промыть | TBS, содержащий 2,5% полисорбат 20 | Температура в комнате | 5 мин, 3 раза |
| 5 | Флуоресценция вторичных антител (1:1000) | Блокирующий буфер | Температура в комнате | 1 ч |
| 6 | Промыть | TBS, содержащий 2,5% полисорбат 20 | Температура в комнате | 5 мин, 3 раза |
Таблица 1: Подробная информация о en лицо иммунофлуоресцентная процедура окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эндотелий подвергается воздействию многочисленных проатерогенных факторов, включая липиды, воспалительные посредники, и жидкость сдвига стресс1,11,12. Прямое наблюдение эндотелиальных клеток на месте дает особые преимущества для анализа изменений в морфологии клеток, межклеточных стыков и молекулярных моделей экспрессии в ответ на повреждения стимулов.
Предыдущие исследования предоставили два различных ан лицо иммуногистохимических методов для наблюдения эндотелия артериальной стенки4,5. Один из них заключается в том, чтобы получить эндотелиальный монослой, зачистив эндотелий от стенки судна с помощью специальной техники, которая трудно освоить и может привести к потере много эндотелия в ветвясь участках артерии4. Другой монтаж всей артериальной стены, как мы описали. Цельномонтажный препарат прост в выполнении и может поддерживать весь эндотелиальныймонослой у кролика и крыс 5,13. Тем не менее, распространение всего мыши аорты плоский не легко, и неспособность сделать это может в значительной степени повлиять на качество наблюдения. Подготовка образца аорты, как описано здесь, с кривизнами разрезать и светящейся поверхности сталкиваются вниз на крышку, делает его легче распространять аорты образца плашмя на слайд стекла. Кроме того, лазерное сканирование конфокальный микроскоп требуется, чтобы лучше сосредоточиться на тонкой эндотелиальной клетки монослой, выстилающий кровеносный сосуд.
Ключевым моментом этой техники является растяжение образца аорты как можно более плоским, чтобы получить лучшее наблюдение за аортой. Кроме того, гепарин следует добавлять в нормальный солевый перед перфузией, а образец аорты следует осторожно обрабатывать на протяжении всего процесса. Параформальдегид должен быть свежеприготовлен и храниться при 4 градусах Цельсия до использования.
Есть ограничения в этой технике. Во-первых, способность ан лица иммунофлуоресценции для обнаружения субэндотелиальных веществ, таких как отложенные липопротеины низкой плотности, ограничена по сравнению с регулярной иммуногистохимии секций тканей. Во-вторых, флуоресцентные сигналы легко отбеливаются после сканирования конфоковым микроскопом, особенно при выполненииz-оси анализа. Кроме того, экспрессия молекулы-мишени может быть только полуколичественной, в зависимости от ее флуоресцентной интенсивности.
Таким образом, это модифицированные ан лицо иммунофлуоресценции окрашивания техника обеспечивает простой способ анализа морфологии и экспрессии белка шаблон сосудистых эндотелиальных клеток в регионах под различными парадигмами кровотока6,7 и при патогенезае атеросклероза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 81670451, 81770430), Шанхайской программой восходящих звезд (Грант No 17-A1403000), а также Комитетом по науке науки Шанхайского муниципального правительства (Грант No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
