الكشف عن الهجرة وتسلل العدلات في الفئران
Summary
هنا، نقدم ثلاث طرق لتقييم الهجرة العدلات والتسلل في كل من الجسم الحي وفي المختبر. ويمكن استخدام هذه الأساليب لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.
Abstract
العدلات هي عضو رئيسي في الجهاز المناعي الفطري وتلعب أدوارًا محورية في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض وردود الفعل الالتهابية المرضية. يمكن تجنيد العدلات في مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines. يمكن أن يؤدي التسلل الساحق من العدلات إلى تلف الأنسجة العشوائية، كما هو الحال في التهاب المفاصل الروماتويدي (RA). العدلات المعزولة من exudate الباسيتي تستجيب لchemoattractant محددة، N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)، في المختبر في ترانسويل أو زغموند غرفة المقالات. يمكن استخدام تجربة الحقيبة الهوائية لتقييم الضريبة الكيميائية للالعدلات نحو البوليس الدهني (LPS) في الجسم الحي. وكثيرا ما يستخدم نموذج الماوس التهاب المفاصل الناجم عن الساعد (AA) في البحوث RA، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية للأقسام المشتركة مع مكافحة النقوي (MPO) أو اللاستاز المضادة للالعدلات (NE) هو وسيلة راسخة لقياس قياس تسلل العدلات. يمكن استخدام هذه الطرق لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.
Introduction
العدلات هي خلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة وتمثل 50-70٪ من إجمالي خلايا الدم البيضاء في البشر1. العدلات هي واحدة من المستجيبين الأولية خلال الالتهاب الحاد. يمكن تجنيد العدلات إلى مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines الصادرة عن الخلايا المقيمة في الأنسجة2،3،4، والتي تتوسطها التفاعلات بين جزيئات التصاق الخلية على سطح العدلات وخلايا بطانة الرحم الوعائية5. العدلات أساسية لاستضافة الدفاع وتلعب دورا في ردود الفعل الالتهابية المرضية بسبب قدرتها القوية على تلف الأنسجة عن طريق إطلاق أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) وغيرها من الجزيئات الضارة بالأنسجة3،6.
وقد وصفت الدراسات السابقة العديد من بروتوكولات العزلة العدلات من الفئران أو البشر. أوه وآخرون أظهرت طريقة فصل التدرج الكثافة لعزل العدلات البشرية من الدم البشري كله7. ومع ذلك ، فإن عزل العدلات الكافية من دم الفئران أمر صعب بسبب حجم الدم الصغير. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على أعداد كبيرة من العدلات الماوس نقية وقابلة للحياة من السائل الماوس الجانبية، ويمكن استخدام هذه العدلات تنقية الجسم الحي لفحص عدة جوانب من وظائف الخلوية في الجسم الحي، بما في ذلك تسلل العدلات، والهجرة، chemotaxis، انفجار الأكسدة، cytokine وفخ خارج الخلية (NET) الإنتاج8. يمكن استخدام المقالات عبر ويل9 أو مقالات غرفة Zigmond10،11 لتقييم هجرة العدلات في المختبر. ويستخدم نموذج الحقيبة الهوائية لتقييم الهجرة وتسلل العدلات في الجسم الحي. نموذج الحقيبة الهوائية تحت الجلد هو نموذج مناسب في الجسم الحي لدراسة هجرة الخلايا الالتهابية.
تقليديا ، كانت تعتبر العدلات مزيلات مسببات الأمراض في المراحل الحادة من الالتهاب. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن العدلات هي خلايا معقدة تؤدي مجموعة كبيرة ومتنوعة من الوظائف المتخصصة. العدلات يمكن تنظيم العديد من العمليات مثل الإصابة الحادة والإصلاح، تولد الورم، استجابة المناعة الذاتية، والالتهاب المزمن12،13. العدلات أيضا تعديل الاستجابات المناعية التكيفية ويمكن تنظيم الخلايا B والخلايا التائية14،15. نقص كبير في العدلات يؤدي إلى الوفيات أو نقص المناعة الحاد في البشر واستنفاد العدلات في الفئران يؤدي إلى الوفاة، في حين أن التنشيط المفرط أو تجنيد العدلات في الأعضاء يسبب العديد من الأمراض المناعية، مثل التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) والذئبة اللامعة الجهازية (SLE)6. العدلات هي الخلايا الأكثر وفرة في السائل الزليلي لمرضى RA. العدلات تنتج كميات مفرطة من النقويبأوكسيديز (MPO) والإيلاستاز العدلات (NE) عن طريق التدهور، مما يؤدي إلى تفاقم تآكل الغضاريف. MPO هو إنزيم بيروكسيديز أعرب عنه أساسا في حبيبات العدلات16. ويرتبط NE مع تدمير الغضاريف المفصلية17. يمكن استخدام MPO و NE لتقييم حالة هجرة العدلات والتسلل في أنسجة مرضى RA.
توفر هذه المقالة ثلاث طرق تقليدية لتقييم هجرة العدلات العادية المستحثة في كل من الجسم الحي والمختبر ، وكذلك تسلل العدلات المرضية في نموذج التهاب مشترك خاص بالماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكولات مفصلة من العدلات عالية النقاء من الدم المحيطي7، نخاع العظام والأنسجة18 كانت متاحة لفترة طويلة. هنا نعتمد طريقة لعزل العدلات من السائل البتوني19 التي العدلات ناضجة لا تزال معطلة لمزيد من الدراسات المضادة للالتهابات والمضادة للأكسدة.
<p class…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 81430099 و 31500704) ، ومشاريع التعاون والتبادل الدولي (رقم المنحة 2014DFA32950) ، وبرنامج البحوث من جامعة بكين للطب الصيني ( أرقام المنح BUCM-2019-JCRC006 و 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
