Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen
Summary
Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.
Abstract
Neutrofielen zijn een belangrijk lid van het aangeboren immuunsysteem en spelen een centrale rol in de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers en pathologische ontstekingsreacties. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines. Overweldigende infiltratie van neutrofielen kan leiden tot willekeurige weefselschade, zoals bij reumatoïde artritis (RA). Neutrofielen geïsoleerd van peritoneale exudate reageren op een gedefinieerde chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell of Zigmond kamer testen. Het luchtzakje experiment kan worden gebruikt om de chemotaxis van neutrofielen in de richting van lipopolysaccharide (LPS) in vivo te evalueren. Het adjuvante-geïnduceerde artritis (AA) muismodel wordt vaak gebruikt in RA-onderzoek, en immunohistochemische kleuring van gewrichtssecties met anti-myeloperoxidase (MPO) of anti-neutrofiele elastase (NE) antilichamen is een gevestigde methode om te meten neutrofiele infiltratie. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcellen en zijn goed voor 50−70% van de hele witte bloedcellen populatie bij de mens1. Neutrofielen zijn een van de primaire responders tijdens acute ontsteking. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines vrijgegeven door weefsel-resident cellen2,3,4, die wordt bemiddeld door de interacties tussen celhechting moleculen op het oppervlak van neutrofielen en vasculaire endothehelium cellen5. Neutrofielen zijn van fundamenteel belang voor de verdediging en spelen een rol in pathologische ontstekingsreacties vanwege hun krachtige vermogen om weefsel te beschadigen door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en andere weefselbeschadigende moleculen3,6.
Eerdere studies hebben verschillende neutrofiele isolatieprotocollen van muizen of mensen beschreven. Oh et al. demonstreerde een dichtheidgradiëntscheidingsmethode om menselijke neutrofielen te isoleren van heel menselijk bloed7. Echter, de isolatie van voldoende neutrofielen van muisbloed is moeilijk vanwege het kleine bloedvolume. Als alternatief kunnen grote aantallen zuivere en levensvatbare muisneutrofielen worden ontlokt uit muisperitoneale vloeistof, en deze gezuiverde neutrofielen kunnen ex vivo worden gebruikt om verschillende aspecten van cellulaire functies ex vivo te onderzoeken, waaronder neutrofiele infiltratie, migratie, chemotaxis, oxidatieve uitbarsting, cytokine en neutrofiele extracellulaire val (NET) productie8. Transwell assays9 of Zigmond kamer assays10,11 kan worden gebruikt om neutrofiele migratie in vitro te evalueren. Het luchtzakjemodel wordt gebruikt om de migratie en infiltratie van neutrofielen in vivo te evalueren. Het onderhuidse luchtzakjemodel is een handig in vivo diermodel om de migratie van ontstekingscellen te bestuderen.
Traditioneel werden neutrofielen beschouwd als pathogene eliminators in acute ontstekingsfasen. Recente bevindingen hebben echter aangetoond dat neutrofielen gecompliceerde cellen zijn die een aanzienlijke verscheidenheid aan gespecialiseerde functies uitvoeren. Neutrofielen kunnen veel processen reguleren, zoals acuut letsel en reparatie, tumorigenese, auto-immuunrespons en chronische ontsteking12,13. Neutrofielen moduleren ook adaptieve immuunreacties en kunnen B-cellen en T-cellenreguleren 14,15. Een groot tekort aan neutrofielen leidt tot sterfte of ernstige immunodeficiëntie bij mensen en neutrofiele uitputting bij muizen leidt tot dodelijk ongeval, terwijl overmatige activering of rekrutering van neutrofielen in organen verschillende immuunziekten veroorzaakt, zoals reumatoïde artritis (RA) en systemische lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofielen zijn de meest voorkomende cellen in de synoviale vloeistof van RA-patiënten. Neutrofielen produceren overmatige hoeveelheden myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastasase (NE) via afbraak, wat kraakbeenerosie verergert. MPO is een peroxidase enzym voornamelijk uitgedrukt in de korrels van neutrofielen16. NE wordt geassocieerd met gewrichtskraakbeen vernietiging17. MPO en NE kunnen worden gebruikt om de status van neutrofiele migratie en infiltratie in het weefsel van RA-patiënten te evalueren.
Dit artikel biedt drie conventionele methoden om de migratie van normale neutrofielen geïnduceerd, zowel in vivo als in vitro, te evalueren, evenals de infiltratie van pathologische neutrofielen in een muisgewrichtspecifiek ontstekingsmodel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gedetailleerde protocollen van sterk gezuiverde neutrofielen uit perifeer bloed7,beenmerg en weefsels18 zijn beschikbaar voor een lange tijd. Hier nemen we een methode aan om neutrofielen te isoleren van peritoneale vloeistof19 waarin volwassen neutrofielen geïnactiveerd blijven voor verdere ontstekingsremmende en antioxidantstudies.
We gebruikten het luchtzakje experiment om de LPS-geïnduceerde infiltratie van neutrofie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 81430099 en 31500704), Internationale Samenwerkings- en Uitwisselingsprojecten (subsidienummer 2014DFA32950) en het onderzoeksprogramma van de Beijing University of Chinese Medicine ( subsidienummers BUCM-2019-JCRC006 en 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
