マウスの好中球の遊走と浸潤の検出
Summary
ここでは、インビボとインビトロの両方で好中球の移動および浸潤を評価する3つの方法を紹介する。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療薬を発見するために使用することができる。
Abstract
好中球は、自然免疫系の主要なメンバーであり、病原体および病理的炎症反応に対する宿主防御において極めて重要な役割を果たす。好中球は、サイトカインとケモカインの指導を介して炎症部位にリクルートすることができます。好中球の圧倒的な浸潤は、関節リウマチ(RA)のような無差別組織損傷を引き起こす可能性があります。腹膜滲出物から単離された好中球は、規定の化学誘引剤、N-ホルミル-メット・レウフェ(fMLP)、インビトロイントランスウェルまたはジグモンドチャンバーアッセイに応答する。空気袋実験は、生体内のリポ多糖(LPS)に対する好中球の走化力を評価するために使用することができる。アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルはRA研究で頻繁に使用され、抗骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)または抗好中球エラスターゼ(NE)抗体を有する関節切片の免疫組織化学的染色は、十分に確立された測定方法である好中球浸潤。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療法を発見するために使用することができる。
Introduction
好中球は最も豊富な白血球であり、ヒト1の白血球集団全体の50〜70%を占める。好中球は、急性炎症時の主要な応答者の1つである。好中球は、組織常駐細胞2、3、4によって放出されるサイトカインおよびケモカインの誘導を介して炎症部位にリクルートすることができるが、これは好中球と血管内皮細胞5の表面上の細胞接着分子との相互作用によって媒介される。好中球は、防御をホストする基礎であり、活性酸素種(ROS)および他の組織損傷分子3、6の放出を介して組織に損傷を与える強力な能力のために、病理的炎症反応の役割を果たす。
これまでの研究では、マウスまたはヒトからの好中球分離プロトコルをいくつか記載している。Ohら、ヒト好中球を全ヒト血液7から単離する密度勾配分離法を実証した。しかし、マウスの血液から十分な好中球の分離は、血液量が少ないため困難である。あるいは、マウス腹膜液から多数の純粋で生存可能なマウス好中球を引き出し、これらの精製された好中球は、好中球浸潤、移行、走化、酸化バースト、サイトカインおよび好中球細胞外トラップ(NET)産生を含む細胞機能エクスビボのいくつかの側面を調べるためにex vivoを使用することができる。トランスウェルアッセイ9またはジグモンドチャンバーアッセイ10,11は、インビトロで好中球移行を評価するために使用することができる。エアポーチモデルは、生体内の好中球の移動および浸潤を評価するために使用されます。皮下エアポーチモデルは、炎症性細胞の遊散を研究するのに便利な生体内動物モデルである。
従来、好中球は炎症の急性期における病原体排除物質と考えられていた。しかし、最近の知見は、好中球が特殊な機能のかなりの多様性を実行する複雑な細胞であることを示しています。好中球は、急性損傷および修復、腫瘍形成、自己免疫応答、および慢性炎症12、13などの多くのプロセスを調節することができる。好中球はまた、適応免疫応答を調節し、B細胞およびT細胞14、15を調節することができる。好中球の大幅な不足は、ヒトの死亡率または重度の免疫不全をもたらし、マウスの好中球の枯渇は死亡につながるが、臓器中の好中球の過剰な活性化または募集は、関節リウマチ(RA)および全身性エリテマトーシス(SLE)6などのいくつかの免疫疾患を引き起こす。好中球は、RA患者の滑液中で最も豊富な細胞である。好中球は、軟骨侵食を悪化させる分解を介して、骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)および好中球エラスターゼ(NE)の過剰な量を生成します。MPOは、主に好中球16の顆粒に発現するペルオキシダーゼ酵素である。NEは、関節軟骨破壊17に関連している。MPOおよびNEは、RA患者の組織における好中球移動および浸潤の状態を評価するために使用することができる。
本稿は、インビボとインビトロの両方で誘導される正常な好中球の移動を評価する3つの従来の方法と、マウス関節特異的炎症モデルにおける病理学的好中球の浸潤を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
末梢血7、骨髄および組織18からの高度に精製された好中球の詳細なプロトコルは、長い間利用可能であった。ここでは、成熟した好中球がさらなる抗炎症および抗酸化研究のために不活性化されたままである腹膜液19から好中球を分離する方法を採用する。
空気ポーチ実験を用い、LPSによる好中球のインビボの浸潤を…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国自然科学財団(助成金番号81430099および31500704)、国際協力交流プロジェクト(助成金番号2014DFA32950)、北京中国医学大学の研究プログラム(中国) によって支援されました(補助金番号BUCM-2019-JCRC006および2019-JYB-TD013)。
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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