Détection de la migration et de l’infiltration des neutrophiles chez les souris
Summary
Ici, nous présentons trois méthodes pour évaluer la migration et l’infiltration de neutrophiles in vivo et in vitro. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.
Abstract
Les neutrophiles sont un membre important du système immunitaire inné et jouent un rôle central dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes et les réactions inflammatoires pathologiques. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de cytokines et de chemokines. L’infiltration écrasante des neutrophiles peut mener aux dommages aveugles de tissu, tels que dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les neutrophiles isolés de l’exsudation péritonéale répondent à un chimioattractant défini, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro dans les essais de chambre de Transwell ou de Zigmond. L’expérience de poche d’air peut être employée pour évaluer la chimiotaxis des neutrophiles vers le lipopolysaccharide (LPS) in vivo. Le modèle de souris de l’arthrite adjuvant-induite (AA) est fréquemment employé dans la recherche de RA, et la coloration immunohistochemical des sections articulaires avec des anticorps anti-myeloperoxidase (MPO) ou anti-neutrophile d’élastase (NE) est une méthode bien établie pour mesurer neutrophile infiltration. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.
Introduction
Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et représentent 50 à 70 % de l’ensemble de la population de globules blancs chez l’homme1. Les neutrophiles sont l’un des principaux intervenants pendant l’inflammation aigue. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de la direction des cytokines et des chimiokines libérées par les cellules de tissu-résident2,3,4, qui est médiée par les interactions entre les molécules d’adhérence cellulaire à la surface des neutrophiles et des cellules endothéliumvasculaires 5. Les neutrophiles sont fondamentaux pour accueillir la défense et jouent un rôle dans les réactions inflammatoires pathologiques en raison de leur capacité puissante à endommager les tissus par la libération d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et d’autres molécules tissulairesnuisibles 3,6.
Des études antérieures ont décrit plusieurs protocoles d’isolement des neutrophiles de souris ou d’humains. Oh et coll. ont démontré une méthode de séparation de gradient de densité pour isoler les neutrophiles humains du sang humain entier7. Cependant, l’isolement des neutrophiles suffisants du sang de souris est difficile en raison du petit volume sanguin. Alternativement, un grand nombre de neutrophiles purs et viables de souris peuvent être obtenus du fluide péritonéal de souris, et ces neutrophiles purifiés peuvent être employés ex vivo pour examiner plusieurs aspects des fonctions cellulaires ex vivo, y compris l’infiltration de neutrophile, migration, chemotaxis, burstoxydative, cytokine et neutrophil extracellulaire de production (NET)8. Transwell analyse9 ou Zigmond essais de chambre10,11 peut être utilisé pour évaluer la migration neutrophile in vitro. Le modèle de poche d’air est utilisé pour évaluer la migration et l’infiltration des neutrophiles in vivo. Le modèle sous-cutané de poche d’air est un modèle animal in vivo commode pour étudier la migration des cellules inflammatoires.
Traditionnellement, les neutrophiles étaient considérés comme des éliminateurs pathogènes dans les phases aigues de l’inflammation. Cependant, les résultats récents ont prouvé que les neutrophiles sont des cellules compliquées qui exécutent une variété significative de fonctions spécialisées. Neutrophils peuvent réguler de nombreux processus tels que les blessures et la réparation aigus, tumorigenesis, réponse auto-immune, et l’inflammation chronique12,13. Les neutrophiles modulent également les réponses immunitaires adaptatives et peuvent réguler les cellules B et les lymphocytes T14,15. La pénurie substantielle de neutrophiles entraîne la mortalité ou une grave immunodéficience chez l’homme et l’épuisement des neutrophiles chez la souris entraîne une mortalité, tandis qu’une activation ou un recrutement excessif de neutrophiles dans les organes provoque plusieurs maladies immunitaires, telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’érythématatus systémique (SLE)6. Les neutrophiles sont les cellules les plus abondantes dans le liquide synovial des patients atteints de PR. Les neutrophiles produisent des quantités excessives de myeloperoxidase (MPO) et d’élastase de neutrophile (NE) par dégradation, ce qui exacerbe l’érosion du cartilage. MPO est une enzyme peroxidase principalement exprimée dans les granules de neutrophiles16. NE est associé à la destruction du cartilage articulaire17. MPO et NE pourraient être utilisés pour évaluer l’état de la migration des neutrophiles et l’infiltration dans le tissu des patients atteints de PR.
Cet article fournit trois méthodes conventionnelles pour évaluer la migration des neutrophiles normaux induits in vivo et in vitro, aussi bien que l’infiltration des neutrophiles pathologiques dans un modèle d’inflammation joint-spécifique de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des protocoles détaillés de neutrophiles hautement purifiés provenant du sang périphérique7, de la moelle osseuse et des tissus18 sont disponibles depuis longtemps. Ici nous adoptons une méthode d’isoler des neutrophiles du fluide péritonéal19 dans lequel les neutrophiles mûrs restent inactivés pour d’autres études anti-inflammatoires et antioxydantes.
Nous avons utilisé l’expérience de poche d’air pou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 81430099 et 31500704), international Cooperation and Exchange Projects (numéro de subvention 2014DFA32950), et le programme de recherche de l’Université de médecine chinoise de Beijing ( numéros de subvention BUCM-2019-JCRC006 et 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
