Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones
Summary
Aquí, presentamos tres métodos para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos tanto in vivo como in vitro. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.
Abstract
Los neutrófilos son un miembro importante del sistema inmunitario innato y desempeñan un papel fundamental en la defensa del huésped contra patógenos y reacciones inflamatorias patológicas. Los neutrófilos pueden ser reclutados a sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas. La infiltración abrumadora de neutrófilos puede provocar daño indiscriminado a los tejidos, como en la artritis reumatoide (AR). Neutrófilos aislados del exudado peritoneal responden a un quimioatraer definido, N-formilo-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro en los ensayos de cámara Transwell o Zigmond. El experimento de la bolsa de aire se puede utilizar para evaluar la quimiotaxis de los neutrófilos hacia el lipopolisacárido (LPS) in vivo. El modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA) se utiliza con frecuencia en la investigación de RA, y la tinción inmunohistoquímica de secciones articulares con anticuerpos antimieloperoxidasa (MPO) o antineutrófilos elastasa (NE) es un método bien establecido para medir infiltración de neutrófilos. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.
Introduction
Los neutrófilos son los glóbulos blancos más abundantes y representan entre el 50 y el 70% de toda la población de glóbulos blancos en humanos1. Los neutrófilos son uno de los principales respondedores durante la inflamación aguda. Los neutrófilos pueden ser reclutados en sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas liberadas por células residentes entejidos 2,3,4, que está mediada por las interacciones entre las moléculas de adhesión celular en la superficie de los neutrófilos y las células de endotelio vascular5. Los neutrófilos son fundamentales para albergar defensa y desempeñar un papel en las reacciones inflamatorias patológicas debido a su poderosa capacidad para dañar el tejido a través de la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otras moléculas dañinas para el tejido3,6.
Estudios anteriores han descrito varios protocolos de aislamiento de neutrófilos de ratones o humanos. Oh y otros demostraron un método de separación de gradiente de densidad para aislar a los neutrófilos humanos de toda la sangre humana7. Sin embargo, el aislamiento de suficientes neutrófilos de la sangre del ratón es difícil debido al pequeño volumen sanguíneo. Alternativamente, un gran número de neutrófilos de ratón puros y viables pueden ser obtenidos del fluido peritoneal del ratón, y estos neutrófilos purificados se pueden utilizar ex vivo para examinar varios aspectos de las funciones celulares ex vivo, incluyendo la infiltración de neutrófilos, migración, quimiotaxis, ráfaga oxidativa, citoquina y trampa extracelular de neutrófilos (NET) producción8. Ensayos Transwell9 o ensayos de cámara Zigmond10,11 se pueden utilizar para evaluar la migración de neutrófilos in vitro. El modelo de bolsa de aire se utiliza para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos in vivo. El modelo de bolsa de aire subcutánea es un modelo animal in vivo conveniente para estudiar la migración de células inflamatorias.
Tradicionalmente, los neutrófilos eran considerados como eliminadores de patógenos en fases agudas de la inflamación. Sin embargo, los hallazgos recientes han demostrado que los neutrófilos son células complicadas que realizan una variedad significativa de funciones especializadas. Los neutrófilos pueden regular muchos procesos tales como lesión aguda y reparación, tumorigenesis, respuesta autoinmune, e inflamación crónica12,13. Los neutrófilos también modulan las respuestas inmunitarias adaptativas y pueden regular las células B y las células T14,15. La escasez sustancial de neutrófilos provoca mortalidad o inmunodeficiencia grave en humanos y el agotamiento de los neutrófilos en ratones conduce a la mortalidad, mientras que la activación o el reclutamiento excesivos de neutrófilos en los órganos provoca nifa tras las enfermedades inmunitarias, como la artritis reumatoide (AR) y el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Los neutrófilos son las células más abundantes en el líquido sinovial de los pacientes con AR. Los neutrófilos producen cantidades excesivas de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) a través de la degradación, que exacerba la erosión del cartílago. LA MPO es una enzima peroxidasa expresada principalmente en los gránulos de los neutrófilos16. NE se asocia con la destrucción del cartílago articular17. MPO y NE podrían utilizarse para evaluar el estado de la migración de neutrófilos y la infiltración en el tejido de los pacientes con AR.
Este artículo proporciona tres métodos convencionales para evaluar la migración de neutrófilos normales inducidos in vivo e in vitro, así como la infiltración de neutrófilos patológicos en un modelo de inflamación específica de la articulación del ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos detallados de neutrófilos altamente purificados de sangre periférica7, médula ósea y tejidos18 han estado disponibles durante mucho tiempo. Aquí adoptamos un método de aislar a los neutrófilos del líquido peritoneal19 en el que los neutrófilos maduros permanecen inactivados para estudios antiinflamatorios y antioxidantes adicionales.
Usamos el experimento de la bolsa de aire para explorar la infiltr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81430099 y 31500704), Proyectos de Cooperación Internacional e Intercambio (número de subvención 2014DFA32950), y el programa de investigación de la Universidad de Medicina China de Beijing ( números de subvención BUCM-2019-JCRC006 y 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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