Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos
Summary
Aqui, apresentamos três métodos para avaliar a migração de neutrófilos e infiltração tanto in vivo quanto in vitro. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapêuticas promissoras visando a migração de neutrófilos.
Abstract
Os neutrófilos são um dos principais membros do sistema imunológico inata e desempenham papéis fundamentais na defesa hospedeira contra patógenos e reações inflamatórias patológicas. Os neutrófilos podem ser recrutados para locais de inflamação através da orientação de citocinas e quiminas. A infiltração esmagadora de neutrófilos pode levar a danos teciduais indiscriminados, como na artrite reumatoide (RA). Os nêtrófilos isolados da exoneração peritoneal respondem a um quimioatrativo definido, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro em ensaios de câmara Transwell ou Zigmond. O experimento da bolsa de ar pode ser usado para avaliar a quimiotáxi dos neutrófilos em direção ao lipopolissacarídeo (LPS) in vivo. O modelo de camundongo seduvante induzido por adjuvante (AA) é frequentemente usado em pesquisas de RA, e a coloração imunohistoquímica de seções articulares com anti-mieloperoxidase (MPO) ou anticorpos elastase anti-nêutrons (NE) é um método bem estabelecido para medir infiltração de neutrófilo. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapias promissoras que visam a migração de neutrófilos.
Introduction
Os neutrófilos são os glóbulos brancos mais abundantes e representam 50-70% de toda a população de glóbulos brancos em humanos1. Os neutrófilos são um dos principais respondentes durante a inflamação aguda. Os neutrófilos podem ser recrutados para locais de inflamação através da orientação de citocinas e quimokinas liberadas pelas células residentes em tecido2,3,4, que é mediada pelas interações entre moléculas de adesão celular na superfície de neutrófilos e células de endotelo vascular5. Os neutrófilos são fundamentais para hospedar a defesa e desempenham um papel nas reações inflamatórias patológicas devido à sua poderosa capacidade de danificar o tecido através da liberação de espécies de oxigênio reativa (ROS) e outras moléculas prejudiciais ao tecido3,6.
Estudos anteriores descreveram vários protocolos de isolamento de neutrófilos de camundongos ou humanos. Oh et al. demonstrou um método de separação de gradiente de densidade para isolar neutrófilos humanos de sangue humanointeiro 7. No entanto, o isolamento de neutrófilos suficientes do sangue do rato é difícil devido ao pequeno volume sanguíneo. Alternativamente, um grande número de neutrófilos de rato puro e viável pode ser obtido a partir de fluido peritoneal de camundongos, e esses neutrófilos purificados podem ser usados ex vivo para examinar vários aspectos das funções celulares ex vivo, incluindo infiltração de neutrófilos, migração, quimiotaxe, explosão oxidativa, citocina e armadilha extracelular de nêutrons (NET) produção8. Ensaios transwell9 ou câmara zigmond10,11 podem ser usados para avaliar a migração de neutrófiloino in vitro. O modelo de bolsa de ar é usado para avaliar a migração e infiltração de neutrófilos in vivo. O modelo subcutâneo da bolsa de ar é conveniente no modelo animal vivo para estudar a migração de células inflamatórias.
Tradicionalmente, os neutrófilos eram considerados como eliminadores de patógenos em fases agudas de inflamação. No entanto, descobertas recentes mostraram que os neutrófilos são células complicadas que executam uma variedade significativa de funções especializadas. Os neutrófilos podem regular muitos processos como lesão aguda e reparo, tumorigênese, resposta autoimune e inflamação crônica12,13. Os neutrófilos também modulam as respostas imunes adaptativas e podem regular células B e células T14,15. A escassez substancial de neutrófilos leva à mortalidade ou à imunodeficiência grave em humanos e à esgotamento de neutrófilos em camundongos leva à fatalidade, enquanto a ativação excessiva ou recrutamento de neutrófilos em órgãos causa várias doenças imunológicas, como artrite reumatoide (RA) e lúpus eritematosus sistêmico (SLE)6. Os neutrófilos são as células mais abundantes no fluido sinovial dos pacientes com RA. Os neutrófilos produzem quantidades excessivas de mieloperoxidase (MPO) e elastase de neutrófilo (NE) via degradação, o que agrava a erosão da cartilagem. MPO é uma enzima peroxidase expressa principalmente nos grânulos de neutrófilos16. O NE está associado à destruição articular da cartilagem17. MpO e NE poderiam ser usados para avaliar o status de migração de neutrófilos e infiltração no tecido de pacientes de RA.
Este artigo fornece três métodos convencionais para avaliar a migração de neutrófilos normais induzidos tanto in vivo quanto in vitro, bem como a infiltração de neutrófilos patológicos em um modelo de inflamação específico da articulação do camundongo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocolos detalhados de neutrófilos altamente purificados do sangue periférico7,medula óssea e tecidos18 estão disponíveis há muito tempo. Aqui adotamos um método de isolar neutrófilos do fluido peritoneal19 no qual os neutrófilos maduros permanecem inativados para estudos anti-inflamatórios e antioxidantes.
Usamos o experimento da bolsa de ar para explorar a infiltração induzida pelo LPS de neutrófilos in vi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (os números de subvenção 81430099 e 31500704), Projetos internacionais de Cooperação e Intercâmbio (número de subvenção 2014DFA32950) e o programa de pesquisa da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim ( números de subvenção BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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