Обнаружение миграции и проникновения нейтрофилов в мышах
Summary
Здесь мы представляем три метода оценки миграции нейтрофилов и инфильтрации как in vivo, так и in vitro. Эти методы могут быть использованы для обнаружения перспективных терапевтических препаратов, направленных на нейтрофилов миграции.
Abstract
Нейтрофилы являются одним из основных членов врожденной иммунной системы и играют ключевую роль в защите хозяина от патогенных микроорганизмов и патологических воспалительных реакций. Нейтрофилы могут быть завербованы в места воспаления с помощью цитокинов и хемокинов. Подавляющее проникновение нейтрофилов может привести к неизбирательному повреждению тканей, например, при ревматоидном артрите (РА). Нейтрофилы, изолированные от перитонеального эксцудата, реагируют на определенный химиоатант, N-формо-Мет-Леу-Пхе (fMLP), in vitro в Трансуэлле или Цигмонде камеры анализов. Эксперимент воздушной сумки может быть использован для оценки химиотаксиса нейтрофилов по отношению к липополисахариду (LPS) in vivo. Адъювантный индуцированный артрит (АА) мышь модель часто используется в исследовании РА, и иммуногистохимическое окрашивание совместных секций с анти-миелопероксидазы (MPO) или антитела антитела антибактериальных антитела антибактериальных антитела митрофилов (NE) является устоявшимся методом для измерения нейтрофил инфильтрации. Эти методы могут быть использованы для обнаружения перспективных методов лечения, направленных на нейтрофилов миграции.
Introduction
Нейтрофилы являются наиболее распространенными белыми кровяных телец и составляют 50-70% всей популяции белых кровяных клеток у людей1. Нейтрофилы являются одним из основных ответчиков во время острого воспаления. Нейтрофилы могут быть завербованы в места воспаления с помощью руководства цитокинов и хемокинов, выделяемых клетками-резидентамитканей2,3,4, который опосредован взаимодействиями между молекулами клеточной адгезии на поверхности нейтрофилов и сосудистых эндотелиевых клеток5. Нейтрофилы имеют основополагающее значение для размещения обороны и играют роль в патологических воспалительных реакций из-за их мощной способности повредить ткани через выпуск реактивных видов кислорода (ROS) и других тканей повреждения молекул3,6.
Предыдущие исследования описали несколько протоколов изоляции нейтрофилов от мышей или людей. Oh et al. продемонстрировали метод разделения градиента плотности для изоляции человека нейтрофилов от всей человеческой крови7. Однако, изоляция достаточного нейтрофилов из крови мыши затруднена из-за малого объема крови. Кроме того, большое количество чистых и жизнеспособных нейтрофилов мыши могут быть получены из мыши перитонеальной жидкости, и эти очищенные нейтрофилы могут быть использованы ex vivo для изучения нескольких аспектов клеточных функций ex vivo, в том числе нейтрофилов инфильтрации, миграции, хемотаксиса, окислительного всплеска, цитокина и нейтрофила внеклеточной ловушки (NET) производства8. Трансуэлл анализирует9 или Зигмонд камеры анализы10,11 могут быть использованы для оценки миграции нейтрофилов в пробирке. Модель воздушной сумки используется для оценки миграции и инфильтрации нейтрофилов in vivo. Подкожная модель воздушного мешка является удобной моделью in vivo для изучения миграции воспалительных клеток.
Традиционно нейтрофилы считались возбудителями в острых фазах воспаления. Однако последние результаты показали, что нейтрофилы являются сложными клетками, которые выполняют значительное разнообразие специализированных функций. Нейтрофилы могут регулировать многие процессы, такие как острая травма и ремонт, опухолевое, аутоиммунные реакции, и хроническое воспаление12,13. Нейтрофилы также модулировать адаптивные иммунные реакции и может регулировать В-клеток и Т-клеток14,15. Существенная нехватка нейтрофилов приводит к смертности или тяжелой иммунодефициту у людей и истощению нейтрофилов у мышей приводит к летальному исходу, в то время как чрезмерная активация или вербовка нейтрофилов в органы вызывает несколько иммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА) и системная эритематоза волчанки (СКВ)6. Нейтрофилы являются наиболее распространенными клетками в синовиальной жидкости пациентов РА. Нейтрофилы производят чрезмерное количество миелопероксидаза (MPO) и нейтрофил эластаза (NE) через деградацию, которая усугубляет эрозию хряща. MPO является ферментом пероксидаза в основном выражается в гранулы нейтрофилов16. NE связан с разрушением суставного хряща17. MPO и NE могут быть использованы для оценки состояния миграции нейтрофилов и инфильтрации в ткани пациентов РА.
Данная статья содержит три традиционных метода оценки миграции нормальных нейтрофилов, индуцированных как в виво, так и in vitro, а также проникновение патологических нейтрофилов в модель воспаления сустава мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подробные протоколы высокоочищенных нейтрофилов из периферической крови7,костного мозга и тканей18 имеются в наличии в течение длительного времени. Здесь мы принимаем метод изоляции нейтрофилов из брюшной жидкости19, в котором зрелые нейтрофилы о…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номера 81430099 и 31500704), международного сотрудничества и обмена проектов (грант номер 2014DFA32950), а также научно-исследовательская программа Пекинского университета китайской медицины ( номера гранта BUCM-2019-JCRC006 и 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
