마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지
Summary
여기에서, 우리는 생체외 및 시험관내 둘 다 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3개의 방법을 제시합니다. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료법을 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Abstract
호중구는 선천적인 면역 계통의 중요한 일원이고 병원체 및 병리학적인 선동적인 반응에 대하여 호스트 방어에 있는 중추적인 역할을 합니다. 호중구는 사이토 카인과 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집 될 수 있습니다. 호중구의 압도적 인 침투는 류마티스 관절염 (RA)과 같은 무차별 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 후막 삼출액으로부터 분리된 호중구는 정의된 화학유고력제, N-포밀-메트-레-페(fMLP), 트랜스웰 또는 지그몬드 챔버 어세에서 시험관내 반응한다. 공기 파우치 실험은 생체 내에서 리포폴리사카라이드(LPS)를 향하여 호중구의 화학요법을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 보조제 유도 관절염(AA) 마우스 모델은 RA 연구에서 자주 사용되며, 항-골수페록시다아제(MPO) 또는 항호중구 엘라스타제(NE) 항체를 이용한 관절 절편의 면역조직화학적 염색은 잘 확립된 측정 방법이다. 호중구 침투. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료를 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
호중구는 가장 풍부한 백혈구이며 인간 에서 전체 백혈구 인구의 50-70 %를차지합니다 1. 호중구는 급성 염증 중 주요 응답자 중 하나입니다. 호중구는 조직 상주세포에의해 방출된 사이토카인 및 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집될 수 있다2,3,4,이는 호중구 및 혈관 내피 세포의 표면에 세포 부착 분자 사이의 상호작용에 의해 매개되는5. 호중구는 반응성 산소 종(ROS) 및 기타 조직 손상분자3,6의방출을 통해 조직을 손상시키는 강력한 능력으로 인해 병원성 염증 반응에 대한 역할을 하는 근본적인 방어및 역할을 한다.
이전 연구는 마우스 또는 인간에게서 몇몇 호중구 격리 프로토콜을 기술했습니다. Oh et al. 인간호중구를 전혈로부터 분리시키는 밀도 구배 분리 방법을 7. 그러나, 마우스 혈액에서 충분한 호중구의 분리는 작은 혈액 양 때문에 어렵습니다. 대안적으로, 많은 수의 순수하고 생존 가능한 마우스 호중구는 마우스 복막 유체로부터 유도될 수 있으며, 이들 정제된 호중구는 호중구 침투, 이동, 화학택시, 산화 파열, 사이토카인 및 호중구 외세포(NET)생산8을포함하는 세포 기능의 여러 측면을 검사하기 위해 생체내 생체내 기능을 검사하는데 사용될 수 있다. Transwell공고9 또는 지그몬드 챔버 어세10,11은 시험관내에서 호중구 이동을 평가하는데 사용될 수 있다. 공기 파우치 모델은 생체 내 호중구의 이동 및 침투를 평가하는 데 사용됩니다. 피하 공기 파우치 모델은 염증 세포의 이동을 연구하는 편리한 생체 내 동물 모델이다.
전통적으로 호중구는 급성 염증 단계에서 병원균 제거제로 간주되었습니다. 그러나, 최근 사실 인정은 호중구가 전문화한 기능의 중요한 다양성을 능력을 발휘하는 복잡한 세포이다는 것을 보여주었습니다. 호중구는 급성 손상 및 수리, 종양 발생, 자가 면역 반응 및 만성 염증 과 같은 많은 과정을 조절할 수있습니다 12,13. 호중구는 또한 적응성 면역 반응을 조절하고 B 세포 및 T 세포14,15를조절할 수 있다. 호중구의 실질적인 부족은 인간에서 사망 또는 중증 면역 결핍으로 이어지며 마우스에서 호중구 고갈은 사망으로 이어지며, 장기에서 호중구의 과도한 활성화 또는 모집은 류마티스 관절염(RA) 및전신 성 홍반성 루푸스(SLE)와 같은 여러 면역 질환을 유발한다. 호중구는 RA 환자의 활액에서 가장 풍부한 세포이다. 호중구는 연골 침식을 악화시키는 분해를 통해 과도한 양의 골수페록시다아제(MPO)와 호중구 엘라타아제(NE)를 생성합니다. MPO는 주로호중구(16)의과립에 발현되는 과산화효소이다. NE는 관절 연골파괴와 연관되어 17. MPO 및 NE는 RA 환자의 조직에서 호중구 이동 및 침윤의 상태를 평가하는데 사용될 수 있었다.
본 문서는 생체 내 및 시험관 내에서 유도된 정상 호중구의 이동뿐만 아니라 마우스 관절 특이적 염증 모델에서 병리학적 호중구의 침투를 평가하는 세 가지 통상적인 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
말초 혈액7,골수 및 조직18에서 고도로 정제 된 호중구의 상세한 프로토콜은 오랫동안 사용할 수 있었습니다. 여기에서 우리는 성숙한 호중구가 추가 항염증제 및 항산화 방지 연구를 위해 불활성화남아 있는 복막 액체19에서 호중구를 분리하는 방법을 채택합니다.
우리는 공기 파우치 실험을 사용하여 생체 내에서 호중구…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81430099 및 31500704), 국제 협력 및 교환 프로젝트 (교부수 번호 2014DFA32950), 그리고 중국 의학 대학의 연구 프로그램에 의해 지원되었다 ( 부여 번호 BUCM-2019-JCRC006 및 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
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