Erkennung von Migration und Infiltration von Neutrophilen bei Mäusen
Summary
Hier stellen wir drei Methoden zur Beurteilung der Neutrophilenmigration und -infiltration sowohl in vivo als auch in vitro vor. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapeutika zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.
Abstract
Neutrophile sind ein wichtiges Mitglied des angeborenen Immunsystems und spielen eine zentrale Rolle bei der Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger und pathologische Entzündungsreaktionen. Neutrophile können über die Anleitung von Zytokinen und Chemokinen an Entzündungsstellen rekrutiert werden. Überwältigende Infiltration von Neutrophilen kann zu wahllosen Gewebeschäden führen, wie bei rheumatoider Arthritis (RA). Neutrophile, die aus peritonealem Exutat isoliert sind, reagieren auf ein definiertes Chemolockan, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell- oder Zigmond-Kammertests. Das Luftbeutelexperiment kann verwendet werden, um die Chemotaxis von Neutrophilen in vivo zu Lipopolysaccharid (LPS) zu bewerten. Das adjuvantinduzierte Arthritis-Mausmodell (AA) wird häufig in der RA-Forschung verwendet, und die immunhistochemische Färbung von Gelenkabschnitten mit Antimyeloperoxidase (MPO) oder Anti-Neutrophilen-Elastase-Antikörpern (NE) ist eine etablierte Methode zur Messung Neutrophileninfiltration. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapien zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.
Introduction
Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden weißen Blutkörperchen und machen 50 bis 70% der gesamten weißen Blutkörperchen population beim Menschen1. Neutrophile sind einer der primären Responder bei akuter Entzündung. Neutrophile können an Entzündungsstellen über die Führung von Zytokinen und Chemokinen rekrutiert werden, die von geweberesidenten Zellen2,3,4freigesetzt werden, die durch die Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Neutrophilen und vaskulären Endothelzellen vermittelt wird5. Neutrophile sind von grundlegender Bedeutung für die Wirtsabwehr und spielen eine Rolle bei pathologischen Entzündungsreaktionen aufgrund ihrer starken Fähigkeit, Gewebe durch die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und anderen gewebeschädigenden Molekülen3,6zu schädigen.
Frühere Studien haben mehrere neutrophile Isolationsprotokolle von Mäusen oder Menschen beschrieben. Oh et al. demonstrierte eine Methode zur Trennung des Dichtegradienten, um menschliche Neutrophile aus ganzem menschlichen Blut zu isolieren7. Allerdings ist die Isolierung ausreichender Neutrophilen aus Mausblut aufgrund des geringen Blutvolumens schwierig. Alternativ kann eine große Anzahl von reinen und lebensfähigen Mausneutrophilen aus Mausperitonealflüssigkeit entlockt werden, und diese gereinigten Neutrophilen können ex vivo verwendet werden, um mehrere Aspekte der zellulären Funktionen ex vivo zu untersuchen, einschließlich neutrophiler Infiltration, Migration, Chemotaxis, oxidativen Bursts, Zytokin und neutrophiler extrazellulärer Falle (NET)Produktion 8. Transwell-Assays9 oder Zigmond-Kammer-Assays10,11 können verwendet werden, um neutrophile Migration in vitro zu bewerten. Das Luftbeutelmodell wird verwendet, um die Migration und Infiltration von Neutrophilen in vivo zu bewerten. Das subkutane Luftbeutelmodell ist ein praktisches in vivo Tiermodell, um die Migration von Entzündungszellen zu untersuchen.
Traditionell wurden Neutrophile als Pathogeneliminatoren in akuten Entzündungsphasen betrachtet. Jüngste Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass Neutrophile komplizierte Zellen sind, die eine signifikante Vielfalt an spezialisierten Funktionen ausführen. Neutrophile können viele Prozesse regulieren, wie akute Verletzungen und Reparaturen, Tumorgenese, Autoimmunreaktion und chronische Entzündung12,13. Neutrophile modulieren auch adaptive Immunantworten und können B-Zellen und T-Zellen14,15regulieren. Erheblicher Mangel an Neutrophilen führt zu Sterblichkeit oder schwerer Immunschwäche beim Menschen und neutrophiler Erschöpfung bei Mäusen führt zum Tod, während übermäßige Aktivierung oder Rekrutierung von Neutrophilen in Organen mehrere Immunerkrankungen verursacht, wie rheumatoide Arthritis (RA) und systemische Lupus erythematodes (SLE)6. Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Zellen in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten. Neutrophile produzieren übermäßige Mengen an Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) durch Abbau, was die Knorpelerosion verschärft. MPO ist ein Peroxidase-Enzym, das hauptsächlich in den Granulaten von Neutrophilen16exprimiert wird. NE ist mit Gelenkknorpelzerstörungassoziiert 17. MPO und NE könnten verwendet werden, um den Status der Neutrophilenmigration und Infiltration im Gewebe von RA-Patienten zu bewerten.
Dieser Artikel enthält drei konventionelle Methoden zur Bewertung der Migration normaler Neutrophilen, die sowohl in vivo als auch in vitro induziert werden, sowie die Infiltration pathologischer Neutrophile in einem Mausgelenk-spezifischen Entzündungsmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaillierte Protokolle von hochgereinigten Neutrophilen aus peripherem Blut7,Knochenmark und Gewebe18 sind seit langem verfügbar. Hier nehmen wir eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Peritonealflüssigkeit19 an, bei der reife Neutrophile für weitere entzündungshemmende und antioxidative Studien inaktiviert bleiben.
Wir nutzten das Luftbeutelexperiment, um die LPS-induzierte Infiltration von Neutrophilen in …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81430099 und 31500704), Internationalen Kooperations- und Austauschprojekten (Grant-Nummer 2014DFA32950) und dem Forschungsprogramm der Pekinger Universität für Chinesische Medizin ( BUCM-2019-JCRC006 und 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
