מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים
Summary
כאן, אנו מציגים שלוש שיטות להערכת הגירה נויטרופילים והסתננות הן בvivo והן בתוך מבחנה. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות מבטיח therapeutics פילוח הגירה נויטרופילים.
Abstract
נויטרופילים הם חבר מרכזי של המערכת החיסונית מולדת ולשחק תפקידים מרכזיים הגנה מארחים מפני פתוגנים ותגובות דלקתיות פתולוגי. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים. הסתננות מוחצת של נויטרופילים יכול להוביל נזק לרקמות הבחנה, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA). נויטרופילים מבודדים מתוך התפענות הצפק להגיב הגדרת כימוסטנט מוגדר, N-formyl-Met-מלאו-פה (fMLP), ב מבחנה ב Transwell או הלשכה הקאמרית Zigmond. את הניסוי כיס האוויר ניתן להשתמש כדי להעריך את כימוטקוניות של נויטרופילים לכיוון ליפופוליסכריד (LPS) ב vivo. מודל העכבר המושרה (AA) הנגרמת לעתים קרובות נעשה שימוש במחקר RA, ומכתים אימונוהיסטוכימיה של סעיפים משותפים עם anti-myeloperoxidase (MPO) או אנטי נויטרופילים elastase (NE) נוגדנים היא שיטה מבוססת היטב כדי למדוד הסתננות נויטרופילים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות טיפולים מבטיחים מיקוד הגירה נויטרופילים.
Introduction
נויטרופילים הם הנפוצים ביותר בתאי דם לבנים וחשבון עבור 50 ל-70% של אוכלוסיית כולה של תא דם לבן בבני אדם1. נויטרופילים הם אחד המגיבים העיקריים במהלך דלקת חריפה. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים שוחרר על ידי תאיםתושבהרקמה 2,3,4, אשר מתווך על ידי אינטראקציות בין מולקולות הדבקה התא על פני השטח של התאים נויטרופילים וכלי הדם5. נויטרופילים הם בסיסיים לארח את ההגנה ולשחק תפקיד בתגובות דלקתיות פתולוגי בשל קיבולת רבת עוצמה שלהם כדי לפגוע ברקמות באמצעות שחרורו של מינים חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות לפגיעה ברקמות3,6.
מחקרים קודמים תיארו מספר פרוטוקולים של בידוד נויטרופילים מעכברים או בני אדם. הו ואח ‘ הפגינו שיטת הפרדה בצפיפות מעבר הצבע כדי לבודד נויטרופילים אנושיים מהדם האנושי השלם7. עם זאת, בידוד של נויטרופילים מספיק דם העכבר קשה בגלל נפח הדם הקטן. לחילופין, מספרים גדולים של העכבר טהור ומלא קיימא יכול להיות הכין מתוך נוזל הצפק העכבר, ואת אלה נויטרופילים מטוהרים ניתן להשתמש לשעבר vivo לבחון מספר היבטים של פונקציות הסלולר ex vivo, כולל הסתננות נויטרופילים, הגירה, כימוטווניות, פרץ חמצוני, cy, ו נויטרופילים השמנה מסחטות (NET) 10,11 יכול לשמש להערכת. הגירה של נויטרופילים במבחנה מודל כיס האוויר משמש כדי להעריך את הגירה הסתננות של נויטרופילים ב vivo. מודל כיס האוויר תת עורית הוא נוח במודל בעלי חיים vivo ללמוד הגירה של תאים דלקתיים.
באופן מסורתי, נויטרופילים נחשבו כמו הפתוגן מייבשים בשלבים אקוטי של דלקת. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי נויטרופילים הם תאים מסובכים המבצעים מגוון משמעותי של פונקציות מיוחדות. נויטרופילים יכול לווסת תהליכים רבים כגון פציעה חריפה ותיקון, tuמוריגנזה, תגובה אוטואימונית, דלקת כרונית12,13. נויטרופילים גם לווסת את התגובות החיסונית אדפטיבית יכול להסדיר B תאים ו T תאים14,15. מחסור ניכר של נויטרופילים מוביל לתמותה או כשל חיסוני חמור בבני אדם ו נויטרופילים דלדול בעכברים מוביל הקטלנית, בעוד הפעלה מוגזמת או גיוס של נויטרופילים באיברים גורם למחלות החיסון מספר, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA) ו זאבת מערכתית מאריתסוס (לשיון)6. נויטרופילים הם התאים השופעים ביותר בנוזל אמתחת של חולים RA. נויטרופילים לייצר כמויות מוגזמות של myeloperoxidase (MPO) ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות השפלה, אשר שחיקה הסחוס בייטס. MPO הוא אנזים peroxidase מתבטא בעיקר בגרגירים של נויטרופילים16. NE קשורה להשמדה הסחוס הבין-מולקולרית17. MPO ו-NE יכול לשמש כדי להעריך את הסטטוס של הגירה נויטרופילים הסתננות ברקמת מטופלים RA.
מאמר זה מספק שלוש שיטות קונבנציונליות כדי להעריך את הגירה של המושרה נורמלי מושרה הן ב vivo ו בחוץ גופית, כמו גם חדירה של נויטרופילים פתולוגי במודל העכבר משותף ספציפי לדלקת.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקולים מפורטים של מאוד מטוהרים נויטרופילים מ דם היקפי7, מח עצם ורקמות18 זמינים במשך זמן רב. כאן אנו לאמץ שיטה של בידוד נויטרופילים מתוך נוזל הצפק19 שבו נויטרופילים בוגרת להישאר מופעל עבור אנטי דלקתיות ומחקרים נוגדי חמצון נוספים.
השת…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (הענקת מספרים 81430099 ו 31500704), שיתוף פעולה בינלאומי ופרויקטים Exchange (גרנט מספר 2014DFA32950), ואת תוכנית המחקר של אוניברסיטת בייג של הרפואה הסינית ( הענק מספרים BUCM-2019-JCRC006 ו 2019-איבב-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
