Farelerde Nötrofillerin Göçü ve İnfiltrasyonunun Saptanması
Summary
Burada nötrofil göçünü ve infiltrasyonu hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için üç yöntem sayılmaktadır. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici terapötik keşfetmek için kullanılabilir.
Abstract
Nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir üyesidir ve patojenlere ve patolojik inflamatuar reaksiyonlara karşı konak savunmasında önemli rol oynarlar. Nötrofiller sitokinler ve kemokinler rehberliği ile inflamasyon sitelerine işe alınabilir. Nötrofillerin ezici infiltrasyonu romatoid artrit (RA) gibi gelişigüzel doku hasarına yol açabilir. Periton eksüdasından izole edilen nötrofiller, Transwell veya Zigmond oda tahlillerinde in vitro in in vitro, tanımlanmış bir kemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) yanıt verir. Hava kese deneyi, nötrofillerin lipopolisakkarite (LPS) in vivo doğru kemotaksisini değerlendirmek için kullanılabilir. Adjuvanin neden olduğu artrit (AA) fare modeli RA araştırmalarında sıklıkla kullanılır ve eklem kesitlerinin anti-miyeloperoksidaz (MPO) veya anti-nötrofil elastaz (NE) antikorları ile immünohistokimyasal boyama, ölçüm yapmak için iyi kurulmuş bir yöntemdir. nötrofil infiltrasyonu. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici tedaviler keşfetmek için kullanılabilir.
Introduction
Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresidir ve insanlardaki tüm beyaz kan hücresi popülasyonunun %50−70’ini oluşturmaktadır1. Nötrofiller akut inflamasyon sırasında birincil yanıt layıcılarından biridir. Nötrofiller inflamasyon sitelerine doku yerleşik hücreler tarafından yayımlanan sitokinler ve kemokinler rehberlik yoluyla işe alınabilir2,3,4, nötrofiller ve vasküler endotel hücrelerinin yüzeyindehücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşimler aracılık 5 . Nötrofiller savunma barındırmak için temel ve reaktif oksijen türlerinin serbest bırakılması yoluyla doku zarar güçlü kapasitesi nedeniyle patolojik inflamatuar reaksiyonlarda bir rol oynamak (ROS) ve diğer doku zarar molekülleri3,6.
Önceki çalışmalarda fareler veya insanlar birkaç nötrofil izolasyon protokolleri açıklanmıştır. Oh ve ark. insan nötrofillerini bütün insan kanından izole etmek için yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gösterdi7. Ancak, fare kanyeterli nötrofillerin izolasyon küçük kan hacmi nedeniyle zordur. Alternatif olarak, saf ve canlı fare nötrofil çok sayıda fare periton sıvısı elde edilebilir, ve bu saflaştırılmış nötrofiller nötrofil infiltrasyon, göç, kemotaksis, oksidatif patlama, sitokin ve nötrofil ekstrasellüler tuzak (NET) üretim8dahil olmak üzere hücresel fonksiyonları ex vivo çeşitli yönlerini incelemek için ex vivo kullanılabilir . Transwell tahliller9 veya Zigmond odası tahlilleri10,11 in vitro nötrofil göç değerlendirmek için kullanılabilir. Hava kese modeli in vivo nötrofillerin göç ve infiltrasyon değerlendirmek için kullanılır. Deri altı hava torbası modeli inflamatuar hücrelerin göçincelemek için uygun bir in vivo hayvan modelidir.
Geleneksel olarak, nötrofiller inflamasyon akut aşamalarında patojen eliminatörler olarak kabul edildi. Ancak, son bulgular nötrofiller özel işlevleri önemli bir çeşitlilik gerçekleştirmek karmaşık hücreler olduğunu göstermiştir. Nötrofiller akut yaralanma ve onarım, tümörigenez, otoimmün yanıt ve kronik inflamasyon12,13gibi birçok süreci düzenleyebilir. Nötrofiller de adaptif bağışıklık yanıtları modüle ve B hücreleri ve T hücreleri düzenleyebilir14,15. Nötrofillerin önemli sıkıntısı insanlarda mortalite veya şiddetli immün yetmezlik ve farelerde nötrofil tükenmesine yol açarken, aşırı aktivasyon veya organlarda nötrofil lerin işe alınması romatoid artrit (RA) vesistemik lupus eritematosus (SLE) 6 gibi çeşitli bağışıklık hastalıklarına neden olur. Nötrofiller RA hastalarının sinovyal sıvıen bol hücrelerdir. Nötrofiller, kıkırdak erozyonunu şiddetlendiren bozulma yoluyla aşırı miktarda miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) üretirler. MPO esas olarak nötrofillerin granüllerinde ifade edilen bir peroksidaz enzimdir16. NE eklem kıkırdağı yıkımı ile ilişkilidir17. MPO ve NE, RA hastalarının dokularında nötrofil göçü ve infiltrasyon durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu makalede, hem in vivo hem de in vitro indüklenen normal nötrofillerin göçünü değerlendirmek için üç geleneksel yöntem invivo, hem de bir fare eklem özgü inflamasyon modelipatolojik nötrofillerin infiltrasyonu sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Periferik kan dan yüksek saflaştırılmış nötrofillerin ayrıntılı protokolleri7, kemik iliği ve dokular18 uzun bir süre için kullanılabilir olmuştur. Burada, erişkin nötrofillerin daha fazla anti-inflamatuar ve antioksidan çalışmalar için inaktive kaldığı periton sıvısı19’dan nötrofilleri izole etme yöntemini benimsemekteyiz.
Hava kese deneyini, nötrofillerin LPS kaynaklı infiltrasyonlarını a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 81430099 ve 31500704), Uluslararası İşbirliği ve Değişim Projeleri (hibe numarası 2014DFA32950) ve Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi araştırma programı ( hibe numaraları BUCM-2019-JCRC006 ve 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
