Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi
Summary
Qui, presentiamo tre metodi per valutare la migrazione e l’infiltrazione dei neutrofili sia in vivo che in vitro. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire promettenti terapie mirate alla migrazione dei neutrofili.
Abstract
I neutrofili sono un membro importante del sistema immunitario innato e svolgono ruoli fondamentali nella difesa dell’ospite contro agenti patogeni e reazioni infiammatorie patologiche. Neutrophils possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine. L’infiltrazione schiacciante dei neutrofili può portare a danni indiscriminati ai tessuti, come l’artrite reumatoide (RA). Neutrophils isolato dall’estuoper peritoneale rispondono a un chemioattraente definito, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro nei saggi della camera Transwell o zigzag. L’esperimento della sacca d’aria può essere utilizzato per valutare la chemiotassi dei neutrofili verso il lipopolissaccharide (LPS) in vivo. Il modello murino dell’artrite adiuvante (AA) è spesso usato nella ricerca RA, e la colorazione immunostochimica di sezioni congiunte con anticorpi anti-mieloperossia (MMP) o elagasi anti-neutrofili (NE) è un metodo ben consolidato per misurare infiltrazione neutrofila. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire terapie promettenti che prendono di mira la migrazione dei neutrofili.
Introduction
I neutrofili sono i globuli bianchi più abbondanti e rappresentano il 50-70% dell’intera popolazione di globuli bianchi negli esseri umani1. I neutrofili sono uno dei principali soccorritori durante l’infiammazione acuta. I neutrofili possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine rilasciate dalle cellule residenti nei tessuti2,3,4, che è mediata dalle interazioni tra molecole di adesione cellulare sulla superficie di neutrofili e cellule endotelio vascolare 5. I neutrofili sono fondamentali per la difesa dell’ospite e svolgono un ruolo nelle reazioni infiammatorie patologiche a causa della loro potente capacità di danneggiare i tessuti attraverso il rilascio di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e altre molecole dannose per i tessuti3,6.
Studi precedenti hanno descritto diversi protocolli di isolamento dei neutrofili da topi o esseri umani. Oh e t. ha dimostrato un metodo di separazione del gradiente di densità per isolare i neutrofili umani dal sangue umano intero7. Tuttavia, l’isolamento di neutrofili sufficienti dal sangue di topo è difficile a causa del piccolo volume di sangue. In alternativa, un gran numero di neutrofili di topo puro e vitale può essere suscitato dal liquido peritoneale del topo, e questi neutrofili purificati possono essere utilizzati ex vivo per esaminare diversi aspetti delle funzioni cellulari ex vivo, tra cui l’infiltrazione dei neutrofili, la migrazione, il chemiotaxi, l’esplosione ossidativa, la citochina e la produzione di trapextra extrafilaretiche neutrofila (NET)8. Transwell saggi9 o saggi della camera di zigmond10,11 possono essere utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili in vitro. Il modello della sacca d’aria viene utilizzato per valutare la migrazione e l’infiltrazione di neutrofili in vivo. Il modello sottocutaneo della sacca d’aria è un comodo modello animale in vivo per studiare la migrazione delle cellule infiammatorie.
Tradizionalmente, i neutrofili erano considerati eliminatori patogeni nelle fasi acute dell’infiammazione. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che i neutrofili sono cellule complicate che svolgono una notevole varietà di funzioni specializzate. I neutrofili possono regolare molti processi come lesioni e riparazioni acute, tumorigenesi, risposta autoimmune e infiammazione cronica12,13. Neutrophils anche modulare le risposte immunitarie adattative e può regolare le cellule B e le cellule T14,15. La sostanziale carenza di neutrofili porta alla mortalità o alla grave immunodeficienza nell’uomo e l’esaurimento dei neutrofili nei topi porta alla fatalità, mentre l’attivazione o il reclutamento eccessivo di neutrofili negli organi causa diverse malattie immunitarie, come l’artrite reumatoide (RA) e lupus erythematosus (SLE)6. I neutrofili sono le cellule più abbondanti nel fluido sinoviale dei pazienti affetti da RA. Neutrophils producono quantità eccessive di mieloperossia (MPO) e elastasi neutrofili (NE) attraverso la degradazione, che esacerba l’erosione della cartilagine. MPO è un enzima perossidasi espresso principalmente nei granuli dei neutrofili16. NE è associato alla distruzione della cartilagine articolare17. MPO e NE potrebbero essere utilizzati per valutare lo stato della migrazione dei neutrofili e dell’infiltrazione nel tessuto dei pazienti affetti da RA.
Questo articolo fornisce tre metodi convenzionali per valutare la migrazione di neutrofili normali indotti sia in vivo che in vitro, così come l’infiltrazione di neutrofili patologici in un modello di infiammazione specifico dell’articolazione del topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocolli dettagliati di neutrofili altamente purificati dal sangue periferico7, midollo osseo e tessuti18 sono stati disponibili per lungo tempo. Qui adottiamo un metodo per isolare i neutrofili dal liquido peritoneale19 in cui i neutrofili maturi rimangono inattivati per ulteriori studi anti-infiammatori e antiossidanti.
Abbiamo usato l’esperimento della sacca d’aria per esplorare l’infiltrazione indotta da LPS dei neut…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 81430099 e 31500704), cooperazione internazionale e progetti di scambio (numero di sovvenzione 2014DFA32950), e il programma di ricerca dell’Università di Pechino di medicina cinese ( sovvenzione BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).
Materials
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.1% Safranin O Staining Solution | Solarbio | 8348a | Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0 | Sigma | 324506 | Sterile |
| 100% Ethanol | Beijing Chemical Works | ||
| 100% Methanol | Beijing Chemical Works | ||
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4" Needle | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8" Needle | BD | 305110 | |
| 3% bovine serum albumin (BSA) | Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS | ||
| 3% H2O2 | Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol | ||
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL Syringe | BD | Z683574 | |
| 50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% Ethanol | Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still | ||
| 70% Ethanol | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still | ||
| 80% Ethanol | Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O | ||
| 95% Ethanol | Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O | ||
| Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution | Beyotime | C0165S | |
| ANTIBODIES | |||
| Anti-Myeloperoxidase Antibody | Abcam | ab208670 | |
| Anti-Neutrophil Elastase Antibody | Abcam | ab21595 | |
| Automatic Hematology Analyzer | Sysmex | XS-800i | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml | sigma | 1002036152 | |
| Cover Slip | CITOGLAS | 10212432C | |
| Dial Thickness Gauge | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes, 1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) Premium | PAN | P30-1302 | |
| Gas Anesthesia System | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Hematoxylin Staining Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L3012 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | Density gradient medium |
| Permeabilization Buffer | Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 1× | Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS), 10× | Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved | ||
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| POWDER | |||
| Proteose Peptone | Oxoid | 1865317 | |
| Retrieval Buffer | Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock for IHC | Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O | ||
| Retrieval Buffer B Stock for IHC | Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. | ||
| Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL | BD | 328421 | |
| Slide | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| Stock Isotonic Percoll (SIP) | Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min | ||
| Wash Buffer in Air Pouch Assay | Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
References
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
- Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
- Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
- Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
- Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
- Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
- Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
- Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
- Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
- Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
- Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
- Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
- Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
- Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
- Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).
