Summary
ここで紹介する方法は、in vivo で血管新生または血管透過性に対する試薬の効果を染色なしで評価できます。この方法では、尾静脈からデキストランFITC注射を使用して、血管新生または血管漏出を視覚化します。
Abstract
in vivoでの血管新生を調べるために、いくつかのモデルが開発されています。しかし、これらのモデルのほとんどは複雑で高価であり、特殊な機器を必要としたり、その後の定量分析のために実行したりするのが困難です。ここでは、in vivoでの血管新生を評価するための修飾マトリックスゲルプラグアッセイを紹介します。このプロトコルでは、血管細胞は、血管新生促進剤または血管新生防止試薬の存在下または非本位でマトリックスゲルと混合され、次にレシピエントマウスの背部に皮下注射されました。7日後、デキストラン-FITCを含むリン酸緩衝生理食塩水を尾静脈から注入し、血管内を30分間循環させる。マトリックスゲルプラグを回収し、組織包埋ゲルで包埋した後、12 μm切片を切断して染色せずに蛍光検出を行います。このアッセイでは、高分子量(~150,000 Da)のデキストラン-FITCを使用して機能性血管の長さを示し、低分子量(~4,400 Da)のデキストラン-FITCを使用して新血管の透過性を示すことができます。結論として、このプロトコルは生体内の血管新生の量的な調査に信頼できる、便利な方法を提供できる。
Introduction
血管新生は、既存の血管から新血管を形成するプロセスであり、胚発生、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍発生など、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします1,2,3,4,5。このダイナミックなプロセスには、マトリックスの分解、血管細胞の増殖、管状構造を形成するための移動と自己組織化、および新血管の安定化など、いくつかのステップが含まれます6。血管新生の促進は、心筋梗塞、脳卒中、その他の虚血性疾患の治療において重要であることが実証されており7、血管新生の阻害は、がん8やリウマチ性疾患9の治療において有望な戦略と考えられています。血管新生は創薬の組織化原理と考えられてきた10。したがって、血管新生の程度を評価するための信頼性が高く便利な方法の構築は、血管新生依存性疾患における機械的研究または創薬にとって重要です。
血管新生を評価するために、いくつかのin vitroおよびin vivoモデルが開発されている11。これらのうち、マトリックスゲルチューブ形成アッセイ12のような2次元(2D)モデルは、機能的な管状構造を形成することができない。後肢虚血モデル13,14などの動物モデルは、血管新生過程を再現することができるが、複雑であり、レーザースペックル血流イメージングシステムを必要とする。マトリックスゲルプラグアッセイのような血管形態形成の3Dモデルは、in vivoでの血管新生のプロセスを模倣できるシンプルなプラットフォームを提供する15が、血管新生の検出には免疫組織化学または免疫蛍光染色16,17,18が必要であり、これらはばらつきがあり、視覚化が不十分である。
ここでは、血管細胞をマトリックスゲルと混合し、マウスの背中に皮下注射してプラグを形成する改変マトリックスゲルプラグアッセイのプロトコルについて説明します。プラグでは、血管細胞がマトリックスを分解し、増殖し、移動し、自己組織化して、最終的に内部環境で血流のある機能的な血管を形成する必要があります。その後、蛍光標識デキストランを尾静脈から注入してプラグ内を流れ、標識を可視化して血管新生を示します。血管新生の内容は、血管の長さによって定量的に評価することができる。この方法は、2次元血管新生モデル12では作製できない機能性血管を形成することができ、通常のマトリックスゲルプラグアッセイ11のような複雑な染色プロセスを必要としない。また、後肢虚血モデル13,14,19のレーザースペックル血流イメージングシステムのような高価な特定の機器を必要としません。この方法は、汎用性が高く、低コストで、定量化可能で、実行が容易であり、薬物の血管新生促進能力または抗血管新生能力を決定するために使用したり、血管新生に関与する機械的研究に使用したりできます。
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Protocol
動物を対象とするすべての手順は、温州医科大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました(XMSQ2021-0057、2021年7月19日)。すべての試薬と消耗品は、 材料表に記載されています。
1. 培地の調製
- 10x M199 培地:M199 粉末を 90 mL の脱イオン水で 10 倍の濃度に溶解し、10 mL のウシ胎児血清(FBS)を加え、0.22 μm フィルターに通します。培地を4°Cで最大2か月間保存します。
- 完全内皮培養培地:460 mLの内皮細胞培地(ECM)に、FBS50 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン5 mL、および内皮細胞増殖サプリメント5 mLを加えます。培地を4°Cで最大1か月間保存します。
2. 血管細胞の調製
- 1 x 105 血管細胞 (初代培養内皮前駆細胞14、内皮細胞、または内皮細胞株) を 8 mL の完全な内皮培養培地で 100 mm 組織培養皿に入れ、37 °C および 5% CO2 〜 70% の濃度で培養します。
- 培地を取り出し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で皿を2回すすぎ、付着していない細胞や破片を取り除きます。PBSを除去し、2.21 mM EDTAを含む0.25%トリプシン3 mLを加え、37°Cで1分間インキュベートします。
- 7 mLの完全内皮培養培地でトリプシンを中和し、培養皿から細胞を静かに洗い流します。光学顕微鏡(倍率40倍)で細胞剥離を確認します。
- 細胞懸濁液を15 mLチューブに回収し、400 x g で10分間遠心分離します。上清を除去し、5 mLの完全内皮培養培地で細胞を再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、2 x 106 細胞を含む懸濁液を滅菌1.5 mLチューブに移します。各プラグには1.5 x 106 セルが含まれており、廃棄物の場合は追加の25%セルが使用されます。各グループには、少なくとも 3 つのプラグが含まれています。
注:試験の結果、300 μLのマトリックスゲル中の1.5 x 106 細胞が血管新生の適切な発達につながることがわかったため、実験に選択しました。 - 細胞懸濁液を400 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去します。
3. マトリックスゲルの調製
- 細胞ペレットを含む滅菌済み 1.5 mL チューブを 4 °C のウォーターバスで予冷します。30G 1 mLのインスリンシリンシリンジを4°Cの冷蔵庫で予冷します。
- マトリックスゲルを4°Cのウォーターバスで完全に解凍します。混ぜたり、渦巻いたりしないでください。10x M199 を予冷し、試薬/目的薬物を 4 °C のウォーターバスで試験します。
- 予冷したマトリックスゲルを、10% FBSを含む10x M199と試験する試薬を体積比8.8:1:0.2で混合し、1% FBSと試薬を含むマトリックスゲルとM199混合物を得ます。
- 細胞を400 μLのマトリックスゲル混合物で再懸濁し、気泡が形成されないように穏やかに混合します。マウスが注射の準備が整うまで、チューブを氷上に置いておきます。凝固を避けるために、マトリックスゲル混合物を常に氷上に保管してください。
注:ここでは、1.5 x 106 細胞を含む300 μLのマトリックスゲル混合物を使用して、ゲルプラグを形成しました。ステップ2で25%の追加細胞に従って、25%の追加ゲルを調製します。
4. マウスの準備
- 6〜8週齢の雄のNu / Nuマウス(18〜25 g)を動物麻酔装置のチャンバーでイソフルラン(100%酸素中の3%イソフルラン、1 L / minの流量)で麻酔します。.麻酔が成功した後、正立反射とつま先挟み反射がないことを確認した後、マウスをチャンバーの外に移動させ、マウスをチャンバーから移動させ、マウスに麻酔マスクを装着し、イソフルランの濃度を100%酸素中で1.5%に1L / minの流量で変更します。
注意: 手順全体を通して、温熱パッドを使用して動物に熱サポートを提供します。 - 乾燥を防ぐために、目に獣医の軟膏を使用してください。マウスの手足を操作ボードにうつ伏せの位置にテープで固定します。
5. マトリックスゲル混合物注入
- 300 μL のマトリックスゲル混合物を 30G 針で 1 mL のインスリンシリンジにロードします。気泡の形成を避けてください。マトリックスゲルをすばやく(2分以内に)ロードして、この間の凝固を防ぎます。マトリックスゲルを装填したインスリン注射器をすぐに氷の上に置きます。
- マウスの背中の皮膚を75%アルコールパッドできれいにします。300μLのマトリックスゲル混合物をマウスの背中の片側に皮下注射します。
- マトリックスゲル混合物の漏れを防ぐために、注射部位から針をそっと取り外します。注射部位に小さなこぶがないか確認します(図1)。
- マウスを加熱パッドの上に2分間置き、マトリックスゲル混合物を凝固させてプラグを形成します。
- 手順 5.2 を繰り返します。を 5.4 に変更。マウスの背面の反対側にプラグを作成します。マーカーペンを使用してこぶの端に印を付けます。
- マウスが胸骨臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで観察します。マウスが完全に回復するまで、マウスを別のケージに入れます。22±2°CのSPFクラスの実験動物実験室で、12時間の明暗サイクルで7日間マウスを飼育します。
6.尾静脈からのデキストラン-FITC注射
- マトリックスゲル注入の7後、0.5mgのデキストラン-FITCを500μLの二重蒸留水(ddH2O)で再懸濁し、次いで激しくボルテックスして、最終濃度1μg/μLのデキストラン-FITC溶液を得る。
注:血管新生アッセイには分子量~150 kDaのデキストラン-FITCを使用し、血管透過性アッセイには分子量~4 kDaのデキストラン-FITCを使用してください。 - 50 μLのデキストラン-FITC溶液を29Gシリンジにロードします。
- 尾静脈注射器具にマウスを固定します。75%アルコールコットンボールでテールを洗浄し、尾静脈から50μLのデキストラン-FITCを静かに注入します。
- 注射部位を綿棒で1分間圧迫して出血を止めた後、マウスをケージに30分間戻します。
- 手順 6.3 を繰り返します。および6.4。すべてのマウスがデキストラン-FITC注射を受けるまで。
7. マトリックスのゲルのプラグのコレクション
- PBS(200 mg / kg体重)に1%ペントバルビタールナトリウムを腹腔内に注射し、IACUC承認の手順でマウスを安楽死させます。
- 外科用ハサミを使用してプラグのマークされた境界に沿って皮膚を切断し、マトリックスゲルプラグの上の皮膚を取り除きます。
- プラグを回収し、1x PBSを含む小さなビーカーですすぎ、余分な血液を洗い流します(図2A)。プラグの色は、血液の豊富さと新生血管の内容物を大まかに表すことができます(図3A)。
8. 包埋マトリックスゲルプラグと切片の準備
- 組織包埋カセットのボタンを約0.5 mLの組織包埋ゲルで覆い、すぐにマトリックスゲルプラグを図 2Bに示すように、組織包埋ゲルに目的の向きで配置します。次に、追加の組織包埋ゲルでプラグを埋め込みます。
- カセットを-80°Cの冷凍庫に12時間入れて固化させます。
- 厚切片の作製は、固化したプラグブロックを取り出し、指示に従って凍結ミクロトームを用いて厚さ12μmの切片を切断し、顕微鏡スライドにマウントします。
- 各プラグブロックから5〜10セクションをスライスします。
9. 血管新生の定量化(図3)
- 切片の5つの独立した視野から、波長488nm、倍率10倍の倒立蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得します。
- Image Jソフトウェア(https://imagej.en.softonic.com/)で画像ファイルを開き、 Angiogenesis Analyze ボタンをクリックします。次に、 Analyze HUVEC Phase Contrast ボタンをクリックし、 Stat Results Table に切り替えて情報を収集します。各切片について取得した5枚の蛍光画像をすべて測定します。
- 異なるグループの新血管の全長を分析して、これらのグループ間の血管新生の違いを統計的に評価します。
注:マスターセグメントの総長は、ネオベッセルの全長を示します。新血管の長さを長くする試薬は血管新生促進剤と呼ばれ、新血管の長さを短くする試薬は抗血管新生と呼ばれます。
10. 血管透過性の定量化(図4)
- 切片の5つの独立したフィールドから、波長488nm、倍率20倍の倒立蛍光顕微鏡で蛍光画像を取得します。
- Image J ソフトウェアで画像ファイルを開きます。 [フリーハンド選択 ]ボタンをクリックして漏水領域を丸で囲み、[ 分析 ]メニューをクリックして[ 測定 ]オプションを選択し、漏水領域の領域情報を取得します。漏れ面積と画像面積の比率を使用して、血管透過性を示します。
- 異なるグループからの漏れ面積と画像面積の比率を分析し、これらのグループ間の血管透過性の違いを統計的に評価します。
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Representative Results
図1 は、マトリックスゲル、血管細胞、培地および試薬の混合物を調製する方法を示すフローチャートである。次に、混合物をNu/Nuマウスの背中に皮下注射し、加熱パッドを使用して加熱し、凝固を促進して最終的にゲルプラグを形成しました。
図2A は、蛍光標識デキストランを有する血管を示すためのフローチャートである。蛍光標識デキストランを尾静脈と円から30分間注入したため、ゲルプラグの機能血管に入ることができます。その後、ゲルプラグを回収し、組織包埋ゲルを用いて包埋した(包埋時のマトリックスゲルの配向を 図2Bに示した)。プラグから12μmの厚さ切片(両側5枚)をスライスし、血管新生および/または血管透過性の定量分析のために蛍光写真を撮影しました。
図3 は、抗血管新生試薬パルミチン酸塩と血管新生促進試薬線維芽細胞増殖因子1(FGF1)がゲルプラグの血管新生に及ぼす影響です。 図3A は、ビヒクル、パルミテート、またはFGF1を含むゲルプラグの外観です。血液はゲルプラグの機能的な新血管に入る可能性があり、プラグはさまざまな程度で赤くなります。 図3B は、高分子量のデキストラン-FITCで機能性血管を可視化したマトリックスゲルプラグの蛍光画像です。 図3C は、異なる基の血管長の定量結果である。パルミチン酸は新生血管の長さを大幅に短縮することができますが、FGF1治療は明らかに長さを長くすることができます。
図4 は、血管内皮増殖因子(VEGF)処理の有無にかかわらず、ゲルプラグの血管透過性を比較したものです。 図4A はマトリックスゲルプラグの蛍光画像で、低分子量のデキストラン-FITCでリーク領域を可視化し、矢印で示しています。 図4B は、漏れ面積の定量結果である。VEGF治療群の漏出面積の増加により、VEGFが血管透過性を高めることができることが明らかになりました。
図 1.マウスにおけるゲルプラグの形成を示すフローチャート。 単層培養で培養した維管束細胞を解離し、ペレット化し、内皮細胞培地(ECM)に再懸濁し、計数(I-IV)します。マトリックスゲル混合物(8.8容量のマトリックスゲル、10%FBSおよび0.2容量試薬を添加した1容量の10x M199を含む)にペレット化および再懸濁した後、300μLのゲル混合物をマウスの背中(V-VII)に皮下注射してプラグを形成した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 2.デキストラン-FITC注射と血管新生の定量を示すフローチャート。 (A)デキストラン-FITCを尾静脈(I)から注入した。30分後、ゲルプラグを採取し、包埋し、凍結ミクロトーム(II、III)を用いて切片をスライスした。その後、蛍光顕微鏡(IV)で蛍光画像を撮影し、Image Jソフトウェア(V)を用いて血管新生を定量的に解析した。(B)組織包埋カセットに埋め込まれた場合のマトリックスゲルプラグの向きの図。略語:OCT = 最適切削温度コンパウンド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 3.修飾マトリックスゲルプラグアッセイを用いた血管新生の評価。 (A)代表的なマトリックスゲルプラグの外観。(B)デキストラン-FITCで示されたマトリックスゲルプラグの機能血管の蛍光写真。(C)一元配置分散分析を用いたマトリックスゲルプラグの機能性血管の長さの定量分析。*p<0.05対車両;P<0.001対車両。スケールバーは100μmです。略語:FGF1 =線維芽細胞増殖因子1。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4.修飾マトリックスゲルプラグアッセイを用いた血管透過性の評価。 (A)ゲルプラグ内の血管の代表的な蛍光画像、矢印は漏出部位を示す。(B)スチューデントのt検定を用いた血管透過性を評価するための漏出面積の定量的分析。p<0.001です。スケールバーは100μmです。略語:VEGF =血管内皮増殖因子。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
染色せずに in vivo での血管新生を定量的に評価するための信頼性が高く簡便な方法を紹介します。このプロトコルでは、血管細胞を血管新生促進剤または抗血管新生試薬の存在下でマトリックスゲルと混合し、Nu/Nuマウスの背中に皮下注射してゲルプラグを形成しました(図1)。ゲルプラグ形成の7日後、デキストラン-FITCを静脈内注射し、30分間循環させた。ゲルプラグを回収し、組織包埋ゲルで包埋し、写真撮影用に12 μm切片をスライスしました(図2)。デキストラン-FITCは、染色せずに機能的な血管を示すことができ、新血管の長さを使用して、試薬の血管新生促進機能または抗血管新生機能を定量的に評価できます。このプロトコルで提示された例では、パルミチン酸処理は新生血管の長さを短縮し、FGF1は新生血管の長さを増加させ(図3)、パルミチン酸は抗血管新生性であり、FGF1は血管新生促進性であることを示しました。それに加えて、このプロトコルは血管透過性の評価にも使用できます(図4)。
レシピエントマウスの選択、マトリックスゲルの取り扱いと注入、ゲルプラグの収集、および血管の長さの検出には注意が必要です。6〜8週齢の免疫不全マウスが推奨されますが、C57BL / 6マウスも実行可能です。プラグのばらつきを考慮して、各グループで3〜5個のプラグをお勧めします。血管細胞の数は、異なるグループ間で均等である必要があります。マトリックスゲルは指示に従って慎重に取り扱う必要があり、固化している場合、または粒子状物質または多数の気泡が含まれている場合は使用しないでください。マトリックスゲル調製工程では、マトリックスゲルの最終濃度は80%以上であってはならず、気泡が形成される可能性があるため、渦は許されません。なお、ゲルプラグの形状は結果の再現性に影響を及ぼす可能性があるため、加熱パッドを使用してマトリックスゲルプラグの凝固を促進しました。37°Cの動物用インキュベーターも使用できます。それに加えて、ゲルプラグの埋め込みおよび切片の準備中は、プラグと切片を明るい光から保護し、できるだけ早く蛍光顕微鏡で写真を撮る必要があります。
さまざまな in vivo 血管新生アッセイの中で、マトリックスゲルプラグアッセイは、用途が広く、コストが低く、実行が容易であるため、最も広く使用されている方法の1つです11。しかし、通常のマトリックスゲルプラグアッセイの染色プロセスではエラーが発生しやすいです。プラグは壊れやすく、水分が多いです。染色プロセスに含まれる脱水および固定ステップは、ゲルプラグを歪ませ、血管の長さの評価にさらに影響を与える可能性があります。それに加えて、プラグ内の散在する血管細胞は、通常のマトリックスゲルプラグアッセイで染色され、機能的な血管として認識される場合があります。この修飾マトリックスゲルプラグアッセイの最も重要な利点の1つは、機能的な血管を染色せずに可視化できることです。FITC標識デキストランは血管の表示に使用され、血流のある機能的な血管のみを示すことができるため、このアッセイの利便性と信頼性に寄与しています。
新血管の長さに加えて、透過性は新血管20の機能にも影響する。低分子量(~4,400 Da)の蛍光標識デキストランは、血管の隙間を通過することができ、新血管の透過性を示すために使用できます。必要に応じて、研究者は、低分子量の蛍光標識デキストランと高分子量のデキストランの両方を使用することで、同じゲルプラグで血管新生と血管透過性の両方を評価できます21。
血管新生は、糖尿病13、14、19などの生体内環境22によって影響を受ける可能性がある。このin vivo環境は、これらのin vitroモデルでは再現が困難です。しかしながら、この改変されたプロトコルでは、適切なレシピエントマウスを選択することにより、in vivo環境を容易に再現することができる。それに加えて、異なる血管細胞間の相互作用も血管新生のプロセスに影響を与えます。血管新生における異なった管のセルの貢献を調査するために異なった種類のendothelialセル、平滑筋のセルおよびpericytesを含む管のセルは、このプロトコルのプラグの新容器を形作るために加えることができる。
ただし、この方法にはいくつかの制限もあります。新血管の形成は、ゲルプラグの形状によって影響を受ける可能性があります。また、ゲルプラグに形成された新血管は均一ではない。ゲルプラグの端には、中央部よりも機能的な血管があります(図2A)。したがって、結果はパフォーマーの熟練度によって影響を受ける可能性があります。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、浙江省自然科学基金会(LY22H020005)と中国国家自然科学基金会(81873466)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
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