Summary
השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.
Abstract
מספר מודלים פותחו כדי לחקור אנגיוגנזה in vivo. עם זאת, רוב המודלים הללו מורכבים ויקרים, דורשים ציוד מיוחד, או קשה לבצע אותם לניתוח כמותי לאחר מכן. כאן אנו מציגים בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה להערכת אנגיוגנזה in vivo. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות או היעדר ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת עורית לגבם של עכברים מושתלים. לאחר 7 ימים, מלח חיץ פוספט המכיל dextran-FITC מוזרק דרך וריד הזנב ומופץ בכלי הדם במשך 30 דקות. תקעי ג'ל מטריקס נאספים ומוטבעים בג'ל הטבעה רקמות, ואז חותכים קטעי 12 מיקרומטר לזיהוי פלואורסצנטי ללא כתמים. בבדיקה זו, dextran-FITC עם משקל מולקולרי גבוה (~ 150,000 Da) יכול לשמש כדי לציין כלי דם פונקציונליים לגילוי אורכם, בעוד dextran-FITC עם משקל מולקולרי נמוך (~ 4,400 Da) יכול לשמש כדי לציין את החדירות של neo-vessels. לסיכום, פרוטוקול זה יכול לספק שיטה אמינה ונוחה למחקר כמותי של אנגיוגנזה in vivo.
Introduction
אנגיוגנזה, תהליך היווצרות כלי הדם הניאו-כליים מכלי דם קיימים, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, טרשת עורקים, התפתחות גידולים וכו '.1,2,3,4,5. תהליך דינמי זה כולל מספר שלבים, כולל השפלה של המטריצה, התפשטות תאי כלי דם, הגירה וארגון עצמי ליצירת מבנים צינוריים וייצוב של כלי הדם6. קידום אנגיוגנזה הוכח כקריטי בטיפול באוטם שריר הלב, שבץ וסוגים אחרים של מחלות איסכמיות7 תוך עיכוב אנגיוגנזה נחשב אסטרטגיה מבטיחה בטיפול בסרטן8 ומחלות שגרונית9. אנגיוגנזה נחשבת לעיקרון מארגן לגילוי תרופות10. לפיכך, בניית שיטה אמינה ונוחה להערכת היקף האנגיוגנזה היא קריטית למחקר מכני או גילוי תרופות במחלות תלויות אנגיוגנזה.
מספר מודלים in vitro ו- in vivo פותחו כדי להעריך אנגיוגנזה11. בין אלה, מודלים דו-ממדיים (2-D), כמו בדיקת היווצרות צינור ג'ל מטריצה12, אינם יכולים ליצור מבנים צינוריים פונקציונליים. המודלים של בעלי החיים, כגון איסכמיה של הגפה האחורית מודל13,14, יכולים לשחזר את תהליך האנגיוגנזה אך הם מורכבים ודורשים מערכת הדמיה של זרימת דם בלייזר. מודלים תלת ממדיים של מורפוגנזה וסקולרית, כמו בדיקת תקע ג'ל מטריצה, מספקים פלטפורמה פשוטה שיכולה לחקות את תהליך האנגיוגנזה in vivo15, אך זיהוי אנגיוגנזה דורש אימונוהיסטוכימיה או צביעת אימונופלואורסנציה 16,17,18, שהם משתנים ומדמיינים בצורה גרועה.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה שבו תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריצה והוזרקו תת עורית לחלק האחורי של עכברים כדי ליצור תקע. בתקע, תאי כלי הדם צריכים לפרק את המטריצה, להתרבות, לנדוד ולהתארגן בעצמם כדי ליצור סוף סוף כלי דם פונקציונליים עם זרימת הדם בסביבה הפנימית. לאחר מכן, דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית מוזרק דרך וריד הזנב, כדי לזרום דרך התקע, והתווית מומחשת כדי לציין ניאו-כלי. התוכן של אנגיוגנזה ניתן להעריך כמותית על ידי אורך כלי. שיטה זו יכולה ליצור כלי דם פונקציונליים שלא ניתן לייצר במודלים אנגיוגנזה דו-ממדית12, ואינה זקוקה לתהליך כתמים מורכב כמו בבדיקת תקע ג'ל מטריצה רגילה11. זה גם לא דורש מכשירים ספציפיים יקרים כמו מערכת הדמיה זרימת דם לייזר כתמים באיסכמיה של הגפיים האחוריות מודל 13,14,19. שיטה זו היא רב-תכליתית, זולה, ניתנת לכימות וקלה לביצוע, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את היכולת הפרו-אנגיוגנית או האנטי-אנגיוגנית של תרופות או לשמש במחקר מכני המעורב באנגיוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו (XMSQ2021-0057, 19 ביולי 2021). כל הריאגנטים והחומרים המתכלים מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת מדיום תרבות
- מדיום תרבית M199 10x: יש להמיס אבקת M199 לריכוז של פי 10 עם 90 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ולהוסיף 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ולאחר מכן לעבור דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
- מדיום תרבית אנדותל מלא: הוסף 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, ו-5 מ"ל של תוספת גדילה של תאי אנדותל ל-460 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM). יש לאחסן את המדיום ב-4°C למשך עד חודש אחד.
2. הכנת תאי כלי דם
- תרבית 1 x 105 תאי כלי דם (תאי אב אנדותל ראשונייםבתרבית 14, תאי אנדותל, או קווי תאי אנדותל) עם 8 מ"ל של תרבית אנדותל מלאה בינונית בצלחת תרבית רקמה של 100 מ"מ ב 37 ° C ו 5% CO2 עד 70% מפגש.
- הסר את מדיום התרבית ושטוף את הכלי 2x עם 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) כדי להסיר תאים לא מחוברים ולכלוך. יש להסיר PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין המכיל 2.21 mM EDTA, ולדגור ב-37°C למשך דקה אחת.
- נטרלו את הטריפסין עם 7 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה, ושטפו בעדינות תאים מצלחת התרבית. יש לאשר ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה פי 40).
- יש לאסוף את תרחיף התאים בצינור של 15 מ"ל ובצנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend תאים עם 5 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה.
- לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהעביר תרחיף המכיל 2 x 106 תאים לצינור סטרילי 1.5 מ"ל. כל תקע מכיל 1.5 x 106 תאים, 25% תאים נוספים משמשים במקרה של פסולת. כל קבוצה כוללת לפחות 3 תקעים.
הערה: לאחר ניסויים נמצא כי 1.5 x 106 תאים ב 300 μL של ג'ל מטריצה הוביל להתפתחות נכונה של אנגיוגנזה ולכן נבחר לניסויים. - תרחיף תאי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות לתאי כדור, ולאחר מכן להסיר supernatant.
3. הכנת ג'ל מטריקס
- טרום קירור סטרילי 1.5 מ"ל צינורות המכילים גלולת תא באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. מצננים מראש מזרקי אינסולין 30G 1 מ"ל במקרר 4°C.
- להפשיר לחלוטין ג'ל מטריצה באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. אין לערבב או לערבל. קירור מראש 10x M199 ובדיקת מגיב/תרופת עניין באמבט מים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- יש לערבב ג'ל מטריצה מקורר מראש עם 10x M199 המכיל 10% FBS ואת הריאגנט שייבדק ביחס נפח של 8.8:1:0.2 כדי לקבל ג'ל מטריצה ותערובת M199 המכילה 1% FBS והמגיב.
- יש להשהות תאים עם 400 μL של תערובת ג'ל המטריצה, לערבב בעדינות כדי למנוע יצירת בועות. שמור את הצינור על קרח עד שהעכברים מוכנים להזרקה. שמור את תערובת ג'ל מטריצה על קרח כל הזמן כדי למנוע קרישה.
הערה: כאן, 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה המכילה 1.5 x 106 תאים שימש ליצירת תקע ג'ל. הכינו תוספת של 25% ג'ל לפי 25% תאים נוספים בשלב 2.
4. הכנת עכבר
- מרדימים עכבר Nu/Nu זכר בן 6-8 שבועות (18-25 גרם) בתא מכשיר ההרדמה של בעלי חיים עם איזופלורן (3% איזופלורן ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה). לאחר הרדמה מוצלחת, שאושרה על ידי היעדר רפלקס תיקון ורפלקס צביטת בוהן, הוציאו את העכבר מהחדר, הוציאו את העכבר מהחדר והניחו מסכת הרדמה על העכבר ושנו את ריכוז האיזופלורן ל -1.5% ב -100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה.
הערה: ספק תמיכה תרמית לבעל החיים באמצעות כרית חימום לאורך כל ההליך. - יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש. הדביקו את הגפיים של העכברים על לוח הניתוח במצב נוטה.
5. הזרקת תערובת ג'ל מטריקס
- טען 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה לתוך מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 30G. הימנעו מהיווצרות בועות. טען במהירות את ג'ל המטריצה (תוך 2 דקות) כדי למנוע התמצקות במהלך זמן זה. הניחו מיד את מזרק האינסולין עמוס בג'ל מטריקס על קרח.
- נקו את העור על גבם של עכברים באמצעות רפידות 75% אלכוהול. תת עורית להזריק 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה בצד אחד של החלק האחורי של עכברים.
- הסר בעדינות את המחט מאתר ההזרקה כדי למנוע דליפה של תערובת ג'ל המטריצה. בדקו אם יש גיבנת קטנה באתר ההזרקה (איור 1).
- הניחו את העכבר על כרית החימום למשך 2 דקות כדי לאפשר לתערובת ג'ל המטריקס לנקרש וליצור תקע.
- חזור על שלבים 5.2. ל-5.4. כדי ליצור תקע בצד השני של גב העכבר. סמן את קצות הדבשת באמצעות עט טוש.
- התבונן בעכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. שים את העכבר בכלוב נפרד עד שהוא התאושש לחלוטין. אחסן את העכברים במעבדת בעלי חיים ניסיונית מסוג SPF ב 22 ± 2 ° C עם מחזור אור / חושך של 12 שעות במשך 7 ימים.
6. הזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב
- לאחר 7 ימים של הזרקת ג'ל מטריצה, יש להשהות מחדש 0.5 מ"ג של דקסטרן-FITC עם 500 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול (ddH2O) ולאחר מכן מערבלים באלימות כדי לקבל את תמיסת דקסטרן-FITC בריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם/μL.
הערה: השתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~150 kDa לבדיקת אנגיוגנזה, והשתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~4 kDa לבדיקת חדירות כלי דם. - טען 50 μL של תמיסת dextran-FITC לתוך מזרקי 29G.
- תקן את העכבר במכשיר הזרקת וריד הזנב. נקו את הזנב עם כדור צמר גפן 75% אלכוהול והזריקו בעדינות 50 מיקרוליטר של דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב.
- דחסו את אתר ההזרקה עם צמר גפן למשך דקה אחת כדי לעצור דימום, ואז החזירו את העכברים לכלוב למשך 30 דקות.
- חזור על שלבים 6.3. ו-6.4. עד שכל העכברים יקבלו זריקת דקסטרן-FITC.
7. אוסף תקעי ג'ל מטריקס
- הזרקה תוך-צפקית של 1% נתרן פנטוברביטלי ב-PBS (200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) והרדמת העכברים בהליך מאושר על ידי IACUC.
- חותכים את העור לאורך הגבול המסומן של התקע באמצעות מספריים כירורגיים ולהסיר את העור מעל תקע ג'ל המטריצה.
- אספו את התקע ושטפו בכד קטן עם PBS 1x כדי לשטוף דם עודף (איור 2A). צבע התקע יכול לתאר באופן גס את מידת שפע הדם ואת תכולת כלי הדם (איור 3A).
8. הטמעת תקע ג'ל מטריצה והכנת חתך
- כסו את הכפתור של קלטת ההטבעה של הרקמה בכ-0.5 מ"ל של ג'ל הטבעה של רקמות, ולאחר מכן הניחו מיד את תקע ג'ל המטריצה על ג'ל ההטבעה של הרקמה בכיוון הרצוי כפי שמוצג באיור 2B. לאחר מכן, להטביע את התקע עם ג'ל הטבעה רקמות נוסף.
- הכניסו את הקלטות למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 12 שעות כדי להתמצק.
- להכנת חתך עבה, מוציאים את בלוק התקע המוצק וחותכים מקטעים בעובי 12 מיקרומטר באמצעות המיקרוטום המקפיא בהתאם להוראה, ומרכיבים על שקופיות מיקרוסקופ.
- פורסים 5-10 חלקים מכל בלוק תקע.
9. כימות אנגיוגנזה (איור 3)
- קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 10.
- פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J (https://imagej.en.softonic.com/) ולחץ על הלחצן Angiogenesis Analyze . לאחר מכן, לחץ על לחצן נתח ניגודיות פאזות HUVEC ועבור לטבלת תוצאות סטטיסטיות כדי לאסוף מידע. מדוד את כל 5 תמונות הפלואורסצנטיות שנרכשו עבור כל קטע.
- לנתח את האורך הכולל של neo-vessels מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל באנגיוגנזה בין קבוצות אלה.
הערה: אורך מקטעי האב הכולל מציין את האורך הכולל של כלי הניאו. המגיב שמגדיל את אורך הניאו-כלי נקרא פרו-אנגיוגני, ואילו המגיב שמקטין את אורך הניאו-כלי הוא אנטי-אנגיוגני.
10. כימות חדירות כלי הדם (איור 4)
- קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 20.
- פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J. לחץ על כפתור הבחירה ביד חופשית והקף את אזור הדליפה, ולאחר מכן לחץ על תפריט ניתוח ובחר באפשרות מדידה כדי לקבל את פרטי האזור של אזור הדליפה. השתמש ביחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה כדי לציין חדירות כלי דם.
- נתח את היחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל בחדירות כלי הדם בין קבוצות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 הוא תרשים זרימה המתאר כיצד להכין את התערובת של ג'ל מטריצה, תאי כלי דם, מדיום תרבית ומגיב. לאחר מכן התערובת הוזרקה באופן תת-עורי לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu וחוממה באמצעות כרית חימום כדי להאיץ את הקרישה שלה כדי ליצור לבסוף תקע ג'ל.
איור 2A הוא תרשים זרימה שמציין כלי דם עם תווית פלואורסצנטית של דקסטרן. פלואורסצנט שכותרתו דקסטרן הוזרק דרך וריד הזנב והעיגול למשך 30 דקות, כך שהוא יכול להיכנס לכלי הפונקציונלי בתקע הג'ל. לאחר מכן, אטמי הג'ל נאספו, משובצים באמצעות ג'ל הטבעה של רקמות (הכיוון של ג'ל מטריצה כאשר הוא מוטמע צוין באיור 2B). חתך עבה של 12 מיקרומטר נחתך מהתקעים (5 פרוסות מכל צד) וצולמו תמונות פלורסנט לניתוח כמותי של אנגיוגנזה ו/או חדירות כלי דם.
איור 3 הוא ההשפעה של פלמיטט מגיב אנטי-אנגיוגני וגורם גדילה פיברובלסט מגיב פרו-אנגיוגני 1 (FGF1) על אנגיוגנזה בפקק הג'ל. איור 3A הוא המראה של תקעי ג'ל עם רכב, פלמיטט או FGF1. הדם יכול להיכנס לכלי הניאו פונקציונלי בתקע הג'ל, מה שהופך את התקע לאדום בדרגות שונות. איור 3B הוא התמונה הפלואורסצנטית של תקעי ג'ל מטריצה, שבה כלי הדם הפונקציונליים הודגמו על-ידי דקסטרן-FITC עם משקל מולקולרי גבוה. איור 3C הוא התוצאה הכמותית של אורך כלי הדם של קבוצות שונות. פלמיטט יכול להפחית באופן משמעותי את אורך כלי הדם הניאו-כליים, בעוד שטיפול ב-FGF1 יכול כמובן להגדיל את האורך.
איור 4 משווה את חדירות כלי הדם בפקקי ג'ל עם או בלי טיפול בגורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF). איור 4A הוא תמונה פלואורסצנטית של תקעי ג'ל מטריצה, שבה אזור הדליפה מוצג על-ידי דקסטרן-FITC עם משקל מולקולרי נמוך ומסומן על-ידי חצים. איור 4B הוא התוצאה הכמותית של אזור הדליפה. אזור הדליפה המוגבר בקבוצת הטיפול ב- VEGF גילה כי VEGF יכול להגביר את חדירות כלי הדם.
איור 1. תרשים זרימה המציג היווצרות תקע ג'ל בעכברים. תאי כלי דם בתרבית חד-שכבתית מנותקים, כדוריים, מושעים מחדש עם תווך תאי אנדותל (ECM), ונספרים (I-IV). לאחר כדוריות והשעיה בתערובת ג'ל מטריצה (המכילה 8.8 ג'ל מטריקס נפח, 1 נפח 10x M199 בתוספת 10% FBS ומגיב נפח 0.2), 300 μL של תערובת ג'ל הוזרק תת עורית לחלק האחורי של העכברים (V-VII) כדי ליצור תקעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. תרשים זרימה המציג הזרקת dextran-FITC וכימות אנגיוגנזה. (A) Dextran-FITC הוזרק דרך וריד הזנב (I). לאחר 30 דקות, תקע ג'ל נרכש, הוטמע וחלקים נחתכו באמצעות מיקרוטום הקפאה (II, III). לאחר מכן, תמונות פלואורסצנטיות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (IV) ואנגיוגנזה נותחה כמותית באמצעות תוכנת Image J (V). (B) הדיאגרמה של כיוון תקע ג'ל מטריצה כאשר היא מוטמעת בקלטת הטבעה של רקמות. קיצורים: OCT = תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. הערכת אנגיוגנזה באמצעות בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה. (A) מראה של תקעי ג'ל מטריצה מייצגים. (B) התמונה הפלואורסצנטית של כלי דם פונקציונליים בתקעי ג'ל מטריצה המסומנת על ידי Dextran-FITC. (C) ניתוח כמותי של אורך כלי הדם הפונקציונליים בתקעי ג'ל מטריצה באמצעות ANOVA חד-כיוונית. *P<0.05 לעומת רכב; עמ<0.001 לעומת רכב. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. קיצורים: FGF1 = גורם גדילה פיברובלסט 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. הערכת חדירות כלי הדם באמצעות בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה. (A) תמונת הפלואורסצנטיות המייצגת של כלי הדם בתקע ג'ל, החיצים מציינים את אתר הדליפה. (B) ניתוח כמותי של אזור הדליפה להערכת חדירות כלי הדם באמצעות מבחן t של התלמיד. עמ<0.001. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. קיצורים: VEGF = גורם גדילה אנדותל כלי דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים שיטה אמינה ונוחה להערכה כמותית של אנגיוגנזה in vivo ללא כתמים. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת-עורית לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu כדי ליצור תקע ג'ל (איור 1). לאחר 7 ימים של היווצרות תקע ג'ל, dextran-FITC הוזרק תוך ורידי והופץ במשך 30 דקות. תקע הג'ל נאסף ושובץ בג'ל הטבעה של רקמות, וחתכים של 12 מיקרומטר נחתכו לצילום (איור 2). Dextran-FITC יכול להצביע על כלי פונקציונלי ללא מכתים, ואת אורך neo-vessels ניתן להשתמש כדי להעריך כמותית את הפונקציה pro-angiogenic או anti-angiogenic של ריאגנטים. בדוגמה המוצגת בפרוטוקול זה, טיפול בפלמיטט הפחית את אורך הניאו-כלי-דם, בעוד ש-FGF1 הגדיל את אורך הניאו-כלי הדם (איור 3), מה שהצביע על כך שפלמיטט הוא אנטי-אנגיוגני, בעוד ש-FGF1 הוא פרו-אנגיוגני. מלבד זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש גם להערכת חדירות כלי הדם (איור 4).
יש לנקוט משנה זהירות בבחירת העכברים המקבלים, טיפול והזרקת ג'ל המטריצה, איסוף תקע ג'ל ואיתור אורך כלי הדם. עכברים מדוכאי חיסון בגילאי 6-8 שבועות מומלצים, אם כי עכברי C57BL/6 הם גם מעשיים. בהתחשב בשונות בתקע, מומלץ 3-5 תקעים בכל קבוצה. מספר תאי כלי הדם צריך להיות אפילו בין קבוצות שונות. ג'ל מטריקס צריך להיות מטופל בקפידה על פי ההוראות ואין להשתמש בו אם הוא מוצק או מכיל חומר חלקיקי או בועות רבות. בשלב הכנת ג'ל המטריצה, הריכוז הסופי של ג'ל מטריצה לא צריך להיות פחות מ 80%, מערבולת אסור כמו בועות עשוי להיווצר. יש לציין כי צורת תקע הג'ל עשויה להשפיע על יכולת השחזור של התוצאות, ולכן נעשה שימוש בכרית חימום כדי להאיץ את התמצקות תקע ג'ל המטריצה. ניתן להשתמש גם באינקובטור בעלי חיים של 37 מעלות צלזיוס. מלבד זאת, במהלך הטבעה של תקע ג'ל והכנת חתכים, יש להגן על תקעים וקטעים מפני אור בהיר, ויש לצלם תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהקדם האפשרי.
בין מבחני האנגיוגנזה השונים in vivo , בדיקת תקע ג'ל מטריצה היא אחת השיטות הנפוצות ביותר מכיוון שהיא רב-תכליתית, פחות יקרה וקלה לביצוע11. עם זאת, תהליך הצביעה בבדיקת תקע ג'ל מטריצה רגילה נוטה לשגיאות. התקע שביר ובעל תכולת מים גבוהה. שלבי ההתייבשות והקיבוע הכלולים בתהליך הצביעה עלולים לעוות את תקע הג'ל, ולהשפיע עוד יותר על הערכת אורך כלי הדם. מלבד זאת, תאי כלי הדם המפוזרים בתקע עשויים להיות מוכתמים ומוכרים ככלי דם פונקציונליים בבדיקת תקע ג'ל מטריצה רגילה. אחד היתרונות החשובים ביותר של בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה זה הוא שניתן לדמיין את כלי הדם הפונקציונליים ללא כתמים. דקסטרן שכותרתו FITC שימש לציון כלי דם, וניתן להצביע רק על כלי דם פונקציונליים בעלי זרימת דם, מה שתורם לנוחות ולאמינות של בדיקה זו.
מלבד אורך הניאו-כלי, החדירות משפיעה גם על תפקודם של ניאו-כלים20. דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית עם משקל מולקולרי נמוך (~ 4,400 Da) יכול לעבור דרך הפער בכלי הדם וניתן להשתמש בו כדי לציין את החדירות של ניאו-כלי. במידת הצורך, החוקרים יכולים להעריך הן אנגיוגנזה והן חדירות כלי דם באותו תקע ג'ל באמצעות דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית עם משקל מולקולרי נמוך וזה עם משקל מולקולרי גבוה21.
אנגיוגנזה יכולה להיות מושפעת מהסביבה in vivo 22, כגון סוכרת 13,14,19 וכו '. סביבת in vivo זו קשה לשחזר במודלים אלה במבחנה. עם זאת, בפרוטוקול שונה זה, ניתן לשחזר בקלות את סביבת in vivo על ידי בחירת עכברים מקבלים מתאימים. מלבד זאת, האינטראקציה בין תאי כלי דם שונים משפיעה גם על תהליך האנגיוגנזה. ניתן להוסיף סוגים שונים של תאי כלי דם, כולל תאי אנדותל, תאי שריר חלק ופריציטים, כדי ליצור ניאו-כלי דם בתקע בפרוטוקול זה כדי לחקור את תרומתם של תאי כלי דם שונים באנגיוגנזה.
עם זאת, יש גם כמה מגבלות עבור שיטה זו. היווצרות של neo-כלי יכול להיות מושפע על ידי צורה של תקע ג'ל. יתר על כן, neo-כלי שנוצרו תקע ג'ל הוא אפילו לא אפילו. ישנם כלי דם פונקציונליים יותר בקצה תקע הג'ל מאשר במרכז (איור 2A). לפיכך, התוצאות עשויות להיות מושפעות ממיומנותו של המבצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (LY22H020005), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81873466).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
