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Bioengineering

Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्वांटम डॉट नैनोकणों का उपयोग

Published: August 7, 2016 doi: 10.3791/54307
Automatic Translation
1,2,3,4, 3,4,5
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

Abstract

एक विधि का वर्णन किया है जिसके तहत क्वांटम डॉट (G) नैनोकणों widefield प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) का उपयोग मानव विकृति ऊतक के correlative immunocytochemical अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल हम सोमेटोस्टैटिन के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग मानव somatostatinoma ट्यूमर के Ultrathin epoxy वर्गों immunolabeled है, एक biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी और streptavidin संयुग्मित 585 एनएम कैडमियम सेलेनियम (सीडीएसई) क्वांटम डॉट्स (QDs) के साथ दृश्य से पीछा प्रदर्शित करने के लिए। वर्गों एक मंदिर नमूना ग्रिड तो widefield प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन के लिए एक गिलास स्लाइड पर रखा पर बढ़ रहे हैं। लाइट माइक्रोस्कोपी चमकीले नारंगी प्रतिदीप्ति ट्यूमर कोशिका कोशिका द्रव्य के भीतर एक बारीक पैटर्न बनाने के रूप में 585 एनएम QD लेबलिंग का पता चलता है। प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मध्य दूरी बढ़ाई कम से कम लेबलिंग पैटर्न को आसानी से पहचाना जा सकता है और गैर विशिष्ट या पृष्ठभूमि लेबलिंग के स्तर का आकलन किया। यह एक महत्वपूर्ण हैमंदिर से immunolabeling पैटर्न के बाद व्याख्या और रूपात्मक संदर्भ के मूल्यांकन के लिए कदम। एक ही अनुभाग तो सूखी मिट और मंदिर से देखा जाता है। QD जांच अनाकार व्यक्ति स्रावी कणिकाओं में निहित सामग्री से जुड़ी करते हुए देखा गया। छवियाँ ब्याज (आरओआई) के एक ही क्षेत्र correlative विश्लेषण के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा से अर्जित कर रहे हैं। प्रत्येक साधन से छवियों इसी फिर इसी क्षेत्र के मंदिर फैटी पर प्रतिदीप्ति डेटा ओवरले के लिए मिश्रित किया जा सकता है।

Introduction

Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्लेम) क्षणिक गतिशील घटनाओं 1, दुर्लभ घटनाओं 2, 3 और 4 जटिल प्रणालियों के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। कई अलग अलग तकनीकी क्रमपरिवर्तन उपलब्ध 5 सवाल के आधार पर कहा जा रहा है कर रहे हैं, लेकिन एक आम आवश्यकता है कि एक भी नमूना 6 में एक ही संरचना कई माइक्रोस्कोपी तौर तरीकों से ली जाती है। हमारा क्लेम करने के लिए विशेष दृष्टिकोण अभिलेखीय मानव विकृति के ऊतकों का अध्ययन और यहां इस्तेमाल अच्छी तरह से होती है और पहले प्रकाशित किया गया है 7 मामले के लिए विकसित किया गया था। उद्देश्य के लिए एक एकल बायोप्सी या शल्य नमूना और दूसरी से विश्लेषणात्मक डेटा को अधिकतम करने के लिए, प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के immunocytochemical लेबलिंग पैटर्न ultrastructural स्तर पर देखा के संदर्भ स्पष्ट करने में मदद करने के लिए सबसे पहले किया गया था।

क्वांटम डॉट nanocrystals (QDs) एक सार्वभौमिक मार्कर सिस्टम एबीएल की क्षमता प्रदान करते हैंई दोनों के द्वारा देखा जाना चाहिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 8, 9, 10। उनके क्रिस्टलीय मूल संरचना जब उनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 11 से दूर तरंग दैर्ध्य प्रकाश से उत्साहित विभिन्न आकार के QDs प्रतिदीप्ति उत्सर्जन चोटियों की एक विस्तृत श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है। अपने परमाणु वजन इलेक्ट्रॉन घनत्व कि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) या क्षेत्र उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable है उपज के लिए पर्याप्त है। वे विशेष रूप से immunocytochemical अध्ययन के लिए अनुकूल हैं के रूप में भी एकल QDs लक्ष्य अणु 12 प्रति एक QD की एक परम संवेदनशीलता देने के लिए मनाया जा सकता है। इसके अलावा, QD के आधार पर किया है कि वे एक व्यक्ति के मौलिक मानचित्रण के लिए उपयुक्त हस्ताक्षर अधिकारी कर सकते हैं।

मानव विकृति नमूने translational जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। सर्जिकल ऊतक और बायोप्सी नमूने नियमित रूप biobanking के लिए और approp के साथ प्रस्तुत कर रहे हैंriate नैतिकता मंजूरी अनुसंधान अध्ययन के लिए पहुँचा जा सकता है। मानव ऊतकों प्रासंगिकता या व्याख्या के मुद्दों है कि जानवर में या रोग के इन विट्रो मॉडल में हो सकता है नहीं है। हालांकि, विकृति विज्ञान के नमूनों का नमूना तैयार अक्सर इष्टतम नहीं है। ऊतक में देरी लगानेवाला में रखा जा रहा है हो सकता है, अनुचित लगानेवाला ऐसे glutaraldehyde formalin बजाय मंदिर और अनुचित नमूना लेने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया। भूखों मरना तरीकों नैदानिक ​​और शकुन जानकारी एक ही मानव नमूना से उपलब्ध अनुकूलन करने की क्षमता है। हालांकि, इस तरह के रोजगार मिनी स्वेटर ऑक्सीजन जनरेटर (miniSOG) उन के रूप में कुछ नव विकसित correlative दृष्टिकोण के लिए टैग आनुवंशिक रूप से ब्याज 13 की सेल में इनकोडिंग जा करने के लिए की आवश्यकता के कारण विकृति में उपयोग के लिए उपलब्ध नहीं हैं। इस कारण से हम correlative immunocytochemical अध्ययन के लिए नियमित रूप से तैयार मंदिर ऊतक के QD लेबलिंग की उपयोगिता का पता लगाया है। QDs नक्काशी epoxy या ली से ऐक्रेलिक राल वर्गों के लिए लागूghtly एल्डिहाइड तय बायोप्सी और ऊतकों के नमूनों एक भी नमूना से correlative प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी और मंदिर डेटा प्राप्त करने की संभावना प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. ऊतक विच्छेदन और फिक्सेशन

  1. ऊतक विच्छेदन
    1. एक शल्य चिकित्सा resected ट्यूमर नमूना या ऊतक बायोप्सी से ऊतक टुकड़े काटना।
      नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल ऊतक को नियमित formalin में तय की गई थी, लेकिन ताजा ऊतक भी उपयुक्त है। हम एक क्षेत्र की पुष्टि की और एक संरचनात्मक रोगविज्ञानी द्वारा रिपोर्ट के बाद दिनचर्या ऊतकीय धुंधला और विरोधी सोमेटोस्टैटिन immunostaining (नहीं दिखाया गया है) somatostatinoma ट्यूमर को रोकने के लिए चयन किया।
    2. ऊतक के टुकड़े कोई लगभग 1.0 मिमी 3 से बड़ा प्रयोग करें।
  2. Cacodylate बफर तैयारी
    1. सोडियम cacodylate के 21.4 ग्राम जोड़कर एक शेयर बफर समाधान (1 एम) तैयार करें (देखें माल की सूची) और आसुत जल के 90 मिलीग्राम और फिर 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा का हल टॉपिंग के लिए 3.0 1 मिलीलीटर% कैल्शियम क्लोराइड समाधान। समाधान हलचल और इतना है कि क्रिस्टलीय अभिकर्मक पूरी तरह घुल रात भर खड़े करने के लिए छोड़ दें।
  3. लगानेवाला तैयारी और प्रयोग
    1. 50% glutaraldehyde समाधान में से एक 10 मिलीलीटर इंजेक्शन की शीशी सोडियम cacodylate शेयर समाधान (1 एम) के 20 मिलीलीटर जोड़ें। 190 मिलीलीटर के लिए आसुत जल से ऊपर। पीएच की जाँच करें और 1 जोड़कर 7.4 करने के लिए समायोजित - 3% हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) यदि आवश्यक हो के 4 बूँदें।
    2. आसुत जल के साथ शीर्ष 200 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए।
    3. एक गिलास नमूना ट्यूब में 4 ओ सी में 24 घंटे के लिए 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर पीएच 7.4 में 2.5% glutaraldehyde युक्त लगानेवाला में ऊतक विसर्जित कर दिया। 1 सप्ताह के बाद अप्रयुक्त लगानेवाला त्यागें।

2. ऊतक प्रसंस्करण और एम्बेडिंग

  1. आज़मियम Tetroxide धुंधला
    1. निर्धारण पूर्ण होने के बाद 20 मिनट के लिए सोडियम cacodylate बफर (0.1 एम) में ऊतक को विसर्जित कर दिया तो एक और 20 मिनट के लिए दोहराएँ।
    2. के अंतिम मात्रा बनाने के लिए सोडियम cacodylate बफर स्टॉक समाधान (1 एम) के 2.0 मिलीग्राम और आसुत जल से 10.0 मिलीलीटर के लिए एक 5% Oso 4 स्टॉक समाधान के 8.0 मिलीलीटर जोड़कर एक 2% जलीय आज़मियम tetroxide (Oso 4) काम कर समाधान तैयार 20.0 मिलीलीटर।
    3. हटाये बफर तो कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए Oso 4 2% में ऊतक विसर्जित 7.4 पीएच पर।
      जब decanting और Oso 4 समाधान तैयारी चेतावनी! का प्रयोग सावधानी, हर समय एक धूआं हुड में उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और काम पहनते हैं।
  2. Uranyl एसीटेट धुंधला
    1. ऊतक osmication पूर्ण होने पर, Oso 4 समाधान निकालने और 10 मिनट के लिए 2% सोडियम एसीटेट में ऊतक विसर्जित कर दिया। हटाये 2% सोडियम एसीटेट तो पर 1 घंटे के लिए 2% uranyl एसीटेट में विसर्जितकमरे का तापमान।
  3. निर्जलीकरण
    1. वर्गीकृत एल्कोहल के माध्यम से ऊतक निर्जलीकरण। 10 मिनट के लिए और कमरे के तापमान पर प्रत्येक 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के दो परिवर्तन के लिए 10 मिनट, 95% इथेनॉल के लिए 10 मिनट के लिए 50% इथेनॉल, 70% इथेनॉल का प्रयोग करें।
    2. 30 मिनट प्रत्येक के लिए 100% एसीटोन के दो बदलाव को पूरा करें।
  4. राल संसेचन और इलाज
    1. एक डिस्पोजेबल कप में पॉलीथीन कम चिपचिपापन epoxy राल मिक्स। विनाइल Cyclohexene डाइऑक्साइड (ERL 4221) epoxy मोनोमर की 10.0 जी, polypropylene ग्लाइकोल का diglycidyl ईथर के 6 ग्राम (DER 732) और nonenyl succinic एनहाइड्राइड (एनएसए) के 26.0 ग्राम जोड़ें। 2 मिनट के लिए लकड़िया का उपयोग कर हाथ से अच्छी तरह से हलचल।
    2. 2-dimethylaminoethanol (DMAE) epoxy त्वरक के पंद्रह बूँदें जोड़ें और 2 मिनट के लिए फिर से हलचल। पूरी तरह से DMAE त्वरक जोड़ने से पहले ERL, डेर और एनएसए घटकों का मिश्रण करने के लिए ध्यान रखना।
    3. 1 राल: 1 के साथ 100% एसीटोन की जगह से ऊतक के राल संसेचन शुरूअंत में 100% रात भर राल 3 घंटे के लिए एसीटोन के लिए 1 राल, और: 1 घंटे के लिए एसीटोन, तो 6 के साथ बदलें।
    4. 8 मिमी micromoulds में ताजा राल में ऊतक स्थानांतरण। 70 ओ सी रातोंरात इलाज। राल मुश्किल है लेकिन इलाज के बाद भंगुर नहीं होना चाहिए।

3. Ultramicrotomy

  1. चाकू, काटना पैरामीटर्स और धारा मोटाई
    1. ultramicrotome में एक semithin हीरे की चाकू की जगह और 500 एनएम के एक मोटाई में ऊतक से वर्गों में कटौती।
    2. धार के पीछे पानी के स्नान पर वर्गों फ्लोट। एक गिलास स्लाइड पर वर्गों उठाओ और ओ सी पर लगभग 110 एक hotplate का उपयोग कर 10 से 20 सेकंड के लिए उन्हें नीचे सूखी
    3. 20 सेकंड के लिए सोडियम ethoxide समाधान के साथ वर्गों खोदना और फिर 100% इथेनॉल तो आसुत जल से धो लें। 2% methylene 20 सेकंड के लिए 1% बोरेक्स में नीले hotplate पर साथ दाग, 5 सेकंड के लिए 5 सेकंड के लिए नल का पानी चल रहा है और hotplate पर सूखे से कुल्ला। तब stain 5 सेकंड के लिए hotplate तो 20 सेकंड के लिए hotplate पर सूखे पर 1.5% बुनियादी fuchsin के साथ।
    4. उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच करने और है कि ट्यूमर कोशिकाओं और ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र पुष्टि खंड में मौजूद हैं।
    5. एक ultrathin हीरे की चाकू को semithin हीरे की चाकू बदलने के लिए और के रूप में चाकू निर्माता से सिफारिश की सही चाकू कोण और कटौती की गति निर्धारित किया है।
    6. 90 एनएम मोटाई में ultrathin वर्गों में कटौती। वर्गों जब नहाने के पानी पर तैरते की सोने की रंगाई का निरीक्षण करें।
    7. खिंचाव और एक 1 सेमी 2 वर्गों के कुछ मिलीमीटर के भीतर फिल्टर पेपर के टुकड़े से क्लोरोफॉर्म वाष्प लहराते द्वारा वर्गों समतल। पानी की सतह के साथ संपर्क में क्लोरोफॉर्म लथपथ कागज लाने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  2. Ultrathin धारा ग्रिड बढ़ते
    1. एक 300 जाल पतली-बार निकल मंदिर ग्रिड का उपयोग कर पानी की सतह कि खंड adhesiv में भिगोया गया है से ultrathin वर्गों लिफ्टई समाधान। ग्रिड की सुस्त पक्ष पर वर्गों का पता लगा। ग्रिड एक तरफ और दूसरी तरफ एक पॉलिश या चमकदार सतह पर एक सुस्त या मैट सतह है। कोई समर्थन फिल्म की आवश्यकता है। नोट: यह संदंश से चिपके हुए ग्रिड से बचने के लिए विरोधी चुंबकीय संदंश के साथ इन ग्रिडों को संभालने के लिए आवश्यक है।
    2. 5 में स्पष्ट चिपकने वाला टेप के 20 सेमी रखने एसीटोन के 2.0 मिलीलीटर के साथ शीशी मिलीलीटर अनुभाग द्वारा चिपकने वाला तैयार करें। कैप और शीशी हिला, 10 मिनट के लिए खड़े तो टेप चिपकने वाला समाधान छोड़ने को दूर करते हैं।

4. immunolabeling

  1. एंटीजन अनमास्किंग
    1. आसुत जल में ताजा संतृप्त सोडियम metaperiodate नक़्क़ाशी समाधान के 1 मिलीलीटर तैयार है और इसे तुरंत का उपयोग करें। एक साफ labfilm सतह पर नक़्क़ाशी समाधान के प्लेस बूंदों।
    2. पूरी तरह से सूखे ग्रिड 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सोडियम metaperiodate समाधान की बूंदों पर नीचे वर्गों के साथ रखें। आसुत जल Dro करने के लिए ग्रिड स्थानांतरणकपड़े धोने के 60 सेकंड के लिए plets।
  2. एंटीबॉडी ऊष्मायन और QD जांच लेबलिंग
    1. समाधान की बूंदों एक साफ Parafilm सतह पर रखा गया पर सभी incubations और लेबलिंग प्रदर्शन करना।
    2. अनुभाग में अवशिष्ट एल्डिहाइड ब्लॉक करने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.05 एम ग्लाइसिन की एक छोटी बूंद पर ग्रिड रखें। संक्षेप में ग्रिड के किनारे सोख्ता द्वारा एल्डिहाइड ब्लॉक निकालें।
    3. 10 मिनट के लिए पीबीएस में 1% सामान्य बकरी सीरम (NGS) और 1% BSAC (10%) की एक छोटी बूंद पर ग्रिड रखें। 1,000 μl के अंतिम मात्रा देने के लिए NGS के 10 μl और पीबीएस के 890 μl को BSAC के 100 μl जोड़कर अवरुद्ध समाधान तैयार है।
    4. 10 मिनट के लिए एंटीबॉडी मंदक की एक छोटी बूंद पर रखकर वर्गों हालत।
    5. विरोधी सोमेटोस्टैटिन पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी एंटीबॉडी मंदक 3.47 छ / एल की एकाग्रता देने के साथ पतला 1:10 का उपयोग कर immunolabeling ऊष्मायन प्रदर्शन करना। नोट: एंटीबॉडी ऊष्मायन कमरे temperat पर 1 घंटे के लिए बूंदों पर ग्रिड रखकर किया जाता हैएक नम कक्ष में Ure।
    6. कदम 4.2.5 से एंटीबॉडी अभिकर्मक हटाये ग्रिड के किनारे सोख्ता द्वारा तो 2 एक्स 5 मिनट के लिए मंदक पर वर्गों धो लें।
    7. माध्यमिक एंटीबॉडी (biotinylated बकरी विरोधी खरगोश पॉलीक्लोनल) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पतला 1:10 में सेते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें। 2 एक्स 5 मिनट के लिए मंदक में धो लें।
    8. streptavidin संयुग्मित QDs (585 एनएम) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पतला 1:10 में सेते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर ऊष्मायन के दौरान प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए।
    9. 2 मिनट के लिए ताजा आसुत जल में ग्रिड धो लें। ग्रिड सूखे के किनारों दाग।

5. प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी

  1. प्रकाश स्रोत और फ़िल्टर क्यूब्स
    1. 365 एनएम प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए रोशनी का प्रयोग करें। निम्नलिखित विशेषताओं के साथ एक फिल्टर क्यूब डालें: (पूर्व जी 365 एनएम, बी एस एफटी 395 और ईएम एल.पी. 420 एनएम)।
      नोट: यह फिल्टर क्यूब wबीमार की अनुमति सब QDs का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा आकार एक ही उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के तहत एक साथ देखे जा करने के लिए।
  2. देखना और इमेजिंग धारा
    1. immunostained ग्रिड खंड एक गिलास स्लाइड पर नीचे पानी की एक छोटी बूंद में रखें और एक गिलास को कवर पर्ची (मोटाई नंबर 1.5) के साथ कवर। लेबलिंग पैटर्न, किसी भी गैर विशिष्ट लेबलिंग के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें और स्थापित करने के लिए है कि नकारात्मक नियंत्रण लेबलिंग का स्पष्ट कर रहे हैं।
    2. ग्रिड सलाखों के संबंध में रॉय को पहचानें। खोजक ग्रिड लक्ष्य संरचनाओं के समन्वय स्थापित करने के लिए सहायक हो सकता है।
    3. "फ्लोरिडा ऑटो रंग" और "सफेद शेष" 3,200K पर सेट पर कैमरा सेटिंग के साथ एक पूर्ण रंग डिजिटल कैमरे का उपयोग खंड पर सकारात्मक लेबलिंग की छवियों मोल। छवियों की उपस्थिति और "एनालॉग लाभ" 1x पर सेट अनुकूलन करने के लिए 0.45 और 1.00 के बीच एक "गामा" की स्थापना के साथ "स्वत: जोखिम" मोड में कैमरा का प्रयोग करें।ज़ेन 2 लाइट सॉफ्टवेयर चित्रमय इंटरफेस में कैमरा आइकन पर क्लिक करें "लाइव", छवि तो ध्यान केंद्रित Framestore करने के लिए छवि पर कब्जा करने के लिए "तस्वीर" पर क्लिक करें।
    4. छवियों को बचाने के रूप में .tif संपीड़न और पिक्सलेशन स्पष्ट होता जा रहा से बचने के लिए दायर किया।
    5. ग्रिड सलाखों या अन्य महत्वपूर्ण स्थलों के ऊतकों के संबंध में रॉय की स्थिति दिखा एक प्रिंट तैयार करें। इन प्रिंट अनुभाग के बाद नेविगेशन और फिर से पाने के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा ROIs के लिए उपयोगी हो जाएगा।
    6. स्लाइड से ग्रिड निकालें, आसुत पानी में धो लें और धीरे किनारों सूखी दाग।
      नोट: प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करने के लिए पीढ़ी तीव्र रोशनी का प्रयोग न करें। QDs की photostability की इमेजिंग बार कुछ सेकंड के लिए अनुमति देता है, लेकिन जोखिम को लम्बा करने के लिए नहीं QD संकेत के शमन के रूप में पानी में लगभग 1 मिनट के बाद हो सकता ख्याल रखना। बढ़ाया या स्थायी photostability ही प्राप्त की है जब QD लेबल वर्गों टोल्यूनि साथ निर्जलित रहे हैं औरप्रति निर्माताओं विनिर्देशों के रूप में coverslips के तहत एम्बेडेड। हालांकि, इस प्रक्रिया तो मंदिर से एक ही अनुभाग के correlative परीक्षा की संभावना को बाहर होगा।

6. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. मंदिर की स्थापना की और देखना
    1. 100 केवी के एक त्वरक वोल्टेज का उपयोग परीक्षा के लिए मंदिर के लिए ग्रिड स्थानांतरण। ग्रिड के आसपास नेविगेट और ROIs कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी विचारों के साथ संबंध स्थापित लगाने के लिए लगभग 1,400X की कम बढ़ाई प्रयोग करें। 50,000X आसपास आवर्धन पर QDs के समूहों देखें।
    2. 70,000X बढ़ाई या ऊपर व्यक्तिगत QDs का निरीक्षण करें। मध्यम इलेक्ट्रॉन घनत्व के साथ अनियमित क्रिस्टलीय संरचना के रूप में QDs का निरीक्षण करें।
  2. इमेजिंग
    1. मंदिर इमेजिंग के लिए एक डिजिटल कैमरे का उपयोग करें। एक मोनोक्रोम 1392 x 1040 पिक्सल सेंसर पर्याप्त है।
    2. माइकर में "पर" "कैमरा" आइकन को क्लिक करके छवियों का मोलइमेजिंग सॉफ्टवेयर की चित्रमय इंटरफेस oscope, तो "बंद" छवि Framestore में स्टोर करने के लिए। नोट: इन आपरेशनों माइक्रोस्कोप सिस्टम के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा अलग होगा। 1.00 की एक "गामा" की स्थापना के साथ स्वत: जोखिम मोड में कैमरा का प्रयोग करें।
    3. फ़ाइलों .tif के रूप में छवियों को बचाओ।

7. भूखों मरना इमेजिंग

  1. मंदिर से एक प्रतिदीप्ति रॉय लगाने
    1. इसी मंदिर से ROIs पता लगाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि से एक प्रिंट का प्रयोग करें। जैसे रक्त वाहिकाओं और ल्यूमिनल संरचनाओं के रूप में ऊतक स्थापत्य सुविधाओं मंदिर का उपयोग खंड के आसपास नेविगेशन के लिए उपयोगी होते हैं।
    2. मंदिर से इसी रॉय की एक छवि पर कब्जा।
  2. भूखों मरना छवि ओवरले
    1. सुनिश्चित करें कि मंदिर छवि को सही ढंग से प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि के साथ केंद्रित है सुनिश्चित करें और प्रत्येक की वृद्धि को सही तो यह है कि एक ही संरचना प्रत्येक साधन के रूप में देखा एक ही आकार है।
    2. पूरबीप्रकाश माइक्रोस्कोपी और मंदिर छवियों खाया और प्रदर्शित उनके पक्ष द्वारा साइड या ओवरले immunolabeled ROIs के Ultrastructural सुविधाओं को उजागर करने के लिए के रूप में।
    3. Photoshop CS2 का उपयोग कर एक ओवरले छवि बनाएं। सबसे पहले, एक कम शक्ति मंदिर छवि के रूप में ही बढ़ाई प्रतिदीप्ति छवि विस्तार। दोनों छवियों बोध कराता है और फिर उन्हें एक कैनवास पर कंधे से कंधा मिलाकर पेस्ट करें।
    4. छविकोफैलाएँ।
    5. इस समग्र छवि से प्रतिदीप्ति ओवरले बनाएँ। "आयताकार उपकरण" पर क्लिक करें प्रतिदीप्ति छवि का चयन करें और इसे से एक नकली परत बना सकते हैं।
    6. "परत शैली / सम्मिश्रण विकल्प" समायोजित करने के लिए 30 - 40% पारदर्शिता।
    7. पर "उपकरण ले जाएँ" क्लिक करें और इसी मंदिर छवि पर प्रतिदीप्ति ओवरले परत खींचें। छवियों को संरेखित।
    8. संरेखण को प्राप्त करने के बाद, "समतल" परतों अंतिम ओवरले छवि का निर्माण करने के लिए।
    9. नई ओवरले छवि एक का चयन करने के लिए "आयताकार उपकरण" का प्रयोग करेंएन डी एक नया कैनवास को कॉपी। एक झगड़ा के रूप में सहेजें।

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Representative Results

somatostatinoma ट्यूमर इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया नमूना नलीपरक संरचनाओं श्लेषजनउत्पादी stomal ऊतक के साथ मिश्रित गठन ट्यूमर कोशिकाओं शामिल थे। प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा, व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं है कि प्रचुर मात्रा में स्रावी कणिकाओं निहित सोमेटोस्टैटिन हार्मोन के लिए सकारात्मक लेबलिंग से पता चला है। नाभिक कम से कम गैर विशिष्ट लेबलिंग detectable (चित्रा 1) के साथ के रूप में अंधेरे छेद दिखाई दिया। कम आवर्धन पर, अस्थायित्व तीव्र बारीक नारंगी प्रतिदीप्ति इन अच्छी तरह से होती ट्यूमर कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य में देखा गया था। प्रतिदीप्ति की नारंगी रंग का इस्तेमाल किया QD के आकार के द्वारा निर्धारित किया गया था। इस अध्ययन के लिए हम 585 एनएम QDs जब 365 एनएम प्रकाश के साथ उत्साहित जो एक नारंगी संकेत फेंकना इस्तेमाल किया।

एक ही सेल के भूखों मरना विश्लेषण संभव (चित्रा 2) था। के रूप में मंदिर परीक्षा की अनुमति दी ROIs के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखी ही ग्रिड का उपयोग कर मान्यता प्राप्त है और im जा करने के लिएदोनों के तौर तरीकों में वृद्ध। ग्रिड सलाखों के संबंध में एक ही ऊतक वास्तुकला के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा मंदिर से मनाया और नेविगेशन के लिए इस्तेमाल किया गया था। रॉय ग्रिड सलाखों के संबंध में एक 20X प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि की चर्चा करते हुए और ऊतक सुविधाओं टिप्पण द्वारा पाया गया था।

मंदिर सोमेटोस्टैटिन सकारात्मक कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य से पता चला है इलेक्ट्रॉन घनत्व बदलती के प्रचुर मात्रा दौर कणिकाओं को रोकने के लिए। विभिन्न व्यास के दानों व्यक्ति की कोशिकाओं में मौजूद थे और granules के ऊपर QD immunolabeling घनत्व भी चर रहा था। मंदिर छवियों पर प्रतिदीप्ति डेटा के मढ़े मजबूत सकारात्मक लेबलिंग मामूली पुटिका सीमित झिल्ली (चित्रा 3) के भीतर घने सामग्री इलेक्ट्रॉन युक्त कणिकाओं के लिए corresponded का सुझाव दिया।

उच्च बढ़ाई मामूली इलेक्ट्रॉन घने कणिकाओं तीव्रता QD nanocrystals (साथ immunolabeled जा करने के लिए देखा जा सकता है

आकृति 1
चित्रा 1:। Somatostatin हार्मोन के लिए लेबल Somatostatinoma कोशिकाओं के साथ एक अति पतली धारा की लाइट माइक्रोस्कोपी देखें Ultrathin खंड एक मंदिर ग्रिड पर रखा गया था, immunolabeled, तो एक coverslip के नीचे पानी में एक गिलास स्लाइड पर रखा। Somatostatinoma कोशिकाओं (तीर) दौर नाभिक और कोशिका द्रव्य में प्रचुर मात्रा में हार्मोन सोमेटोस्टैटिन सकारात्मक कणिकाओं दिखा। लेबलिंग घनत्व में काफी भिन्नता somatostatinoma सेल की आबादी (200x) में देखा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Somatostatin के माध्यम से एक ultrathin धारा से भूखों मरना समग्र दृष्टिकोण ओमा ऊतक Somatostatin ए के लिए लेबल) widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा Somatostatinoma कोशिकाओं (120X);। बी) के एक लुमेन (एल) कम बढ़ाई (570X) पर मंदिर से देखा आसपास ही कोशिकाओं, सी) उच्च शक्ति मंदिर से चमकते फ्लोरोसेंट सेल दिखा दृश्य ( ए) के साथ नाभिक (एन) (2,000X);। डी) छोटा दाना (तारांकन) (20,000X) के भीतर निहित अनाकार सामग्री पर QDs के साथ तीव्र लेबलिंग दिखा साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं का विस्तार यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें ।

चित्र तीन
चित्रा 3:। भूखों मरना ओवरले छवि इसी क्षेत्र (2,000X) के एक मंदिर छवि के साथ मिश्रित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से एक पारदर्शी छवि।/ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। कोशिका द्रव्य अनाकार सामग्री पर (तीर) शो QD स्थानीयकरण काफी हद तक सीमित झिल्ली के भीतर में Somatostatinoma सेल cytoplasm Somatostatin हार्मोन सकारात्मक कणिकाओं से Somatostatin सकारात्मक Granules का संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) देखें। cytoplasmic पृष्ठभूमि आसपास के स्पष्ट कुछ QD जांच के साथ साफ है। कुछ गैर विशिष्ट परमाणु लेबलिंग देखा जाता है। पुटिका कणिकाओं (तीर) के आसपास झिल्ली अभी भी दिखाई दे (50,000X) है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन भूखों मरना अध्ययन के लिए सार्वभौमिक जांच के रूप में QDs की क्षमता उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। 585 एनएम QD इस्तेमाल किया नैनोकणों जब widefield प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखी और तत्काल मंदिर से मनाया गया उज्ज्वल है और स्थिर प्रतिदीप्ति दिखाया। वर्तमान लेखकों में से एक ने पिछले एक अध्ययन से पता चला है QDs भी सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी 7 के लिए उपयुक्त हो। उनके photostability बढ़ाया देखने अवधि और लंबी इमेजिंग निवेश के लिए विशेष रूप से उपयोगी था। QDs भी अलग अलग आकार की जांच एक साथ एक ही उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के तहत अलग अलग रंग स्पेक्ट्रा उत्सर्जन के साथ मल्टीप्लेक्स immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

QDs के अधिकारी पर्याप्त परमाणु वजन मंदिर से देखे जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है लेकिन इस nanoparticle के आकार पर निर्भर चुनौतीपूर्ण हो पाया था। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए, हमने पाया है कि 525 एनएम QDs (हरा) बड़े 585 एनएम (नारंगी) और 655 एनएम (लाल) रूपों की तुलना में कम पृष्ठभूमि लेबलिंग का उत्पादन। हालांकि, हम मंदिर से लेबलिंग के और अधिक सुविधाजनक दृश्य सक्षम करने के लिए वर्तमान अध्ययन में बड़े 585 एनएम QD का उपयोग करने के लिए चुना है। छोटे 525 एनएम QDs आकार के होते हैं लगभग 3 - 5 एनएम जबकि बड़े 585 एनएम रूपों लगभग 6 - 8 एनएम और 655 एनएम QDs लगभग 8 - 10 एनएम। जब मंदिर द्वारा देखी 585 एनएम QDs मध्यम इलेक्ट्रॉन घनत्व के साथ एक अनियमित आकार क्रिस्टलीय के पास थी। वे के रूप में गोल या इलेक्ट्रॉन अधिक परंपरागत कोलाइडयन सोने immunocytochemical जांच के रूप में सघन रूप में नहीं थे। हालांकि, QDs 10X कोलाइडयन सोने 9 से अधिक कुशल लेबलिंग करने के लिए उपज के लिए दिखाया गया है और हम यहाँ की पुष्टि की है कि एक उच्च घनत्व लेबलिंग आसानी से प्राप्त किया गया था, विशेष रूप से बायोटिन streptavidin जांच जोड़ने प्रणाली के साथ। सीडीएसई QDs भी एक विशेषता मौलिक हस्ताक्षर है कि पता लगाने और मानचित्रण ऊर्जा फैलानेवाला स्पेक्ट्रोस्कोपी (एड्स), इलेक्ट्रॉन ऊर्जा नुकसान स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईल) या ऊर्जा फ़िल्टर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग की अनुमति हो सकती अधिकारी (EFTEएम) 8। स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) सिस्टम भी जेड विपरीत या परमाणु संख्या इमेजिंग जो नैनोकणों और निचले परमाणु संख्या 14 के जैविक सामग्री के बीच इसके विपरीत में वृद्धि होगी की उनके शोषण की वजह से नियोजित किया जा सकता है। बड़े क्षेत्र मानचित्रण और क्षेत्र उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ 3 डी वितरण जानकारी 15 के दृश्य भी संभव होना चाहिए।

हमारे विधि में एक महत्वपूर्ण कदम प्रतिजन अनमास्किंग या अनुभाग नक़्क़ाशी प्रक्रिया है। हम कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सोडियम metaperiodate के साथ एक ही इलाज का उपयोग करें। इस और संरचनाओं या झिल्ली परिभाषा के नुकसान के एकत्रीकरण से अधिक समय हो सकता है। दूसरों सोडियम methoxide सोडियम periodate साथ de-osmication द्वारा पीछा के साथ deplasticizing से जुड़े एक दो कदम विधि का इस्तेमाल किया है और यदि आवश्यक हो तो 16 इस प्रक्रिया पर अधिक नियंत्रण प्रदान कर सकता है।

भूखों मरना प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए carefull से संभव हो गया थाY ग्रिड सलाखों के संबंध में ROIs के ढांचागत सुविधाओं लॉग ऑन करें। एक ही ग्रिड तो मंदिर में रखा गया है और केंद्रित है, ताकि ग्रिड सलाखों के पास प्रकाश माइक्रोस्कोपी दृश्य के अनुरूप है। लगभग 1,400X की एक कम बढ़ाई इस के लिए सबसे उपयुक्त है। ऐसे नलीपरक संरचनाओं और नाभिक के पैटर्न के रूप में ऊतक संरचनाओं के ऊतकों में ROIs को फिर से पाने के लिए सबसे अधिक उपयोगी साबित हुई। हालांकि, एक ही सेल संकल्प के साथ सटीक सहसंबंध चुनौतीपूर्ण हो सकता है। जॉब ही उन्मुखीकरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा प्रतिबिंबित करने के लिए ग्रिड के उन्मुखीकरण के साथ लिया जा सकता था। हम फ़ोटोशॉप का उपयोग कर उत्पादन किया ओवरले छवियों के साथ तौर तरीकों के बीच काफी सटीक subcellular स्थानिक सहसंबंध हासिल किया है। प्रतिदीप्ति ओवरले छवि मंदिर पृष्ठभूमि छवि के साथ मिश्रित किया गया लेकिन कुछ misalignment detectable था। यह अलग इमेजिंग सिस्टम प्रत्येक साधन के द्वारा या मंदिर में हमारे असमर्थित ultrathin वर्गों के लिए विकिरण क्षति के लिए इस्तेमाल की वजह से हो सकता है। अनुसूचित जनजाति के लिए स्वचालित प्रणालीROIs के निर्देशांक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा oring और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अब विपणन किया जा रहा करने के लिए इन हस्तांतरण और बहुत ही इस प्रक्रिया को सरल बनाने जाएगा।

भूखों मरना दृष्टिकोण हम immunocytochemical अध्ययन के लिए प्रस्तुत किया है की उपयोगिता आवश्यकता नमूना तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया, यानी, भारी धातु धुंधला और epoxy राल एम्बेडिंग अनिवार्य रूप से उपलब्ध epitopes मास्किंग विधि द्वारा सीमित कर रहा है। हालांकि, तकनीक विकृति के नमूनों से प्रतिदीप्ति और मंदिर डेटा प्राप्त करने का काफी लाभ की अनुमति है। एक भी नमूना का उपयोग कर विभिन्न माइक्रोस्कोपी तौर तरीकों से संरचनात्मक और कार्यात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए कुछ है कि आम तौर पर किया गया है मानव विकृति कोशिकाओं और ऊतकों कि मुख्य रूप से नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए प्रोसेस किया गया की पढ़ाई करने के लिए उपलब्ध किया गया नहीं है।

यह उम्मीद की होगी कि अधिक संवेदनशील immunocytochemical स्थानीयकरण एक फ्रीज निर्धारण दृष्टिकोण के बजाय एक प्रोटोकॉल ख से प्राप्त किया जा सकता हैरासायनिक निर्धारण पर ased। Cryofixation सिद्धांतों के दत्तक ग्रहण 17 मानव क्लासिक Tokuyasu तकनीक 18 के रूप में cryoultramicrotomy और कमरे के तापमान QD आधारित immunolabeling के द्वारा पीछा ऊतक के biobanking के लिए, 19 मानव रोग रोगजनन के संवेदनशील और विशिष्ट correlative immunocytochemical अध्ययन की सुविधा होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium cacodylate Proscitech C0205 Harmful chemical
Osmium tetroxide Proscitech C010 Use only in fume hood
Uranyl acetate Univar-Ajax 569 Hazardous chemical
Ethanol 100% Fronine JJ008
Acetone 100% Fronine JJ006
ERL 4221 Proscitech C056
DER 732 Proscitech C047
NSA Proscitech C059
DMAE Proscitech C050
Sodium metaperiodate Analar BDH 10259
anti-somatostatin antibody Dako A0566
Antibody diluent Dako S3022
Qdot 585 Streptavidin Conjugate  Invitrogen Q10113MP
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody Sigma B7389-1ML
Glutaraldehyde 50% EMS 16320
Normal goat serum Invitrogen PCN5000
PBS "Dulbecco A" Oxoid  BR0014G
BSAc (10%) Aurion 900.022
Parafilm Pechiney PP M
pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) Merck 1.09584.0001
Micromoulds Proscitech RL063
Diamond knife Diatome Ultra 45
Transmission electron microscope FEI Morgagni 268D
Fluorescence light microscope Carl Zeiss Axioscope A1
Grids 300 mesh nickel (thin bar) Agar Scientific G2740N
Ultramicrotome RMC Powertome
TEM camera control software Soft Imaging System AnalySIS Version 3.0
Image processing software Adobe Systems Incorporated Photoshop CS2

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 114 immunocytochemistry क्वांटम डॉट ट्यूमर somatostatinoma भूखों मरना widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्वांटम डॉट नैनोकणों का उपयोग
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Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y.… More

Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles. J. Vis. Exp. (114), e54307, doi:10.3791/54307 (2016).

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