نموذج ماوس غير عشوائي لأعاده تنشيط الدوائية من Mecp2 علي كروموسوم X غير نشط
Summary
هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتوليد نموذج murine الإناث قابله للحياة مع غير عشوائية X كروموسوم التنشيط ، اي ، أمومي الموروثة X الكروموسوم غير نشط في 100 ٪ من الخلايا. ونحن أيضا وصف بروتوكول لاختبار الجدوى ، والتحمل ، وسلامه أعاده تنشيط الدوائية لكروموسوم X غير نشط في الجسم المجري.
Abstract
X صبغ الكروموسوم (XCI) هو إسكات عشوائي لكروموسوم X واحد في الإناث لتحقيق توازن الجرعة الجينية بين الجنسين. ونتيجة لذلك ، فان جميع الإناث غير متجانسة بالنسبة للتعبير الجيني المرتبط بالعاشر. واحده من الجهات التنظيمية الرئيسية لل XCI هو Xci، وهو أمر ضروري لبدء وصيانة xci. وقد حددت الدراسات السابقة 13 من العوامل التي تعمل بالكروموسوم X بالانابه (XCIFs) باستخدام شاشه وراثيه واسعه النطاق لفقدان الوظائف. تثبيط XCIFs ، مثل ACVR1 و PDPK1 ، وذلك باستخدام قصيرة دبوس الشعر RNA أو مثبطات جزيء صغير ، يعيد تنشيط X الجينات المرتبطة كروموسوم في الخلايا المستزرعة. ولكن الجدوى والقابلية لأعاده تنشيط الكروموسوم X غير النشط في الجسم المجري لا يزال يتعين تحديده. نحو هذا الهدف ، xistδ: Mecp2/Xist: تم إنشاء نموذج الماوس Mecp2 Gfp مع xist غير عشوائية بسبب حذف xist علي كروموسوم X واحد. باستخدام هذا النموذج ، تم تحديد مدي أعاده تنشيط X غير نشط في الدماغ الماوس بعد العلاج مع مثبطات XCIF. تظهر النتائج المنشورة مؤخرا ، للمرة الاولي ، ان تثبيط الدوائية من XCIFs يعيد تنشيط Mecp2 من كروموسوم X غير نشط في الخلايا العصبية القشرية من الدماغ الماوس الحية.
Introduction
X صبغ الكروموسوم (XCI) هو عمليه التعويض الجرعة التي يوازن التعبير الجينات المرتبطة X عن طريق إسكات نسخه واحده من كروموسوم X في الإناث1. ونتيجة لذلك ، يتراكم الكروموسوم X غير النشط (Xi) السمات المميزة للهتروكروماتين بما في ذلك ميثيل الحمض النووي والتعديلات المثبطة للهخه ، مثل هيستون H3-يسين 27 ثلاثي ميثيل (H3K27me3) و هيستون H2A اوبيتاميوشن (H2Aub) 2. المنظم الرئيسي لإسكات الكروموسوم x هو مركز التنشيط العاشر (الأكسجين) المنطقة ، حوالي 100 − 500 كيلوبايت ، والتي تتحكم في العد والاقتران من الكروموسومات x ، واختيار عشوائي من كروموسوم x لعدم التنشيط ، والبدء و نشر من إسكات علي طول كروموسوم X3. يتم بدء عمليه التنشيط X بواسطة النسخة المحددة X غير النشطة (Xist) التي تغطي الحادي عشر في رابطه الدول المستقلة للتوسط في إسكات الكروموسومات وأعاده تشكيل البنية ثلاثية الابعاد لكروموسوم x4. في الاونه الاخيره ، وقد حددت العديد من الشاشات البروتينية والوراثية المنظمين اضافيه من xci ، مثل البروتينات المتفاعلة xci 5،6،7،8،9 , 10 , 11 , 12. علي سبيل المثال ، الدراسة السابقة باستخدام الجينوم علي نطاق واسع الجينات تداخل الحمض الريبي كشفت 13 العوامل العابرة لل Xci (xcifs)12. الميكانيكية ، XCIFs تنظيم التعبير Xist التالي ، التداخل مع الدالة xcifs يسبب عيب xci12. معا ، قدمت التطورات الاخيره في الميدان رؤى هامه في آلات الجزيئية المطلوبة لبدء والحفاظ علي XCI.
تحديد المنظمين xci وفهم آليتهم في xci ذات الصلة مباشره بالامراض البشرية المرتبطة ب X ، مثل متلازمة ريت (rtt)13،14. RTT هو اضطراب النمو العصبي النادرة الناجمة عن طفرة غير متجانسة في البروتين الربط العاشر الميثيل-CpG ملزمه 2 (MECP2) الذي يصيب الفتات في الغالب15. لان MECP2 يقع علي الكروموسوم X, الفتات rtt هي متغايرة لنقص MECP2 مع ~ 50% الخلايا التعبير عن نوع البرية و ~ 50% التعبير عن متحولة MECP2. ولا سيما ، RTT خلايا متحولة الميناء نسخه نائمه ولكن البرية من نوع من Mecp2 علي الحادي عشر ، وتوفير مصدر للجينات وظيفية ، والتي إذا أعيد تنشيطها ، يمكن ان تخفف من اعراض المرض. بالاضافه إلى RTT ، هناك العديد من الامراض البشرية الأخرى المرتبطة بالعاشر ، والتي تمثل أعاده تنشيط Xi نهجا علاجيا محتملا ، مثل متلازمة DDX3X.
تثبيط XCIFs ، 3-phosphoinositide البروتين المعتمدة كيناز-1 (PDPK1) ، و activin نوع مستقبلات 1 (ACVR1) ، اما عن طريق قصيرة الحمض الريبي النيبالي (شرانا) أو مثبطات جزيء صغير ، يعيد تنشيط الجينات المرتبطة Xi12. ولوحظ أعاده تنشيط الدوائية من الجينات المرتبطة Xi في مختلف النماذج الجسم السابق التي تشمل خطوط الخلايا الليفية الماوس, الكبار الخلايا العصبية القشرية الماوس, الخلايا الليفية الفئران الجنينية, وخطوط الخلية الليفية المستمدة من المريض RTT12. ومع ذلك ، ما إذا كان التنشيط الدوائي للجينات المرتبطة بالحادي عشر أمرا ممكنا في الجسم الذي لا يزال يتعين إثباته. أحد العوامل المقيدة هو عدم وجود نماذج حيوانيه فعاله لقياس تعبير الجينات بدقه عن أعاده تنشيط الحادي عشر. نحو هذا الهدف ، xistδ: Mecp2/Xist: تم إنشاء نموذج الماوس Mecp2 Gfp الذي يحمل المسمي وراثيا Mecp2 علي Xi في جميع الخلايا بسبب الحذف غير المتجانس في اكسيست علي الام X كروموسوم16. باستخدام هذا النموذج, التعبير عن Mecp2 من الحادي عشر وقد تم تكميمها بعد العلاج مع مثبطات XCIFs في الدماغ من الفئران الحية. هنا ، يتم وصف الجيل من xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp نموذج الماوس ومنهجيه لأعاده تحديد القيمة الحادي عشر في الخلايا العصبية القشرية باستخدام المقايسات القائمة علي المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
سابقا ، تم تحديد XCIFs المطلوبة بشكل انتقائي لإسكات الجينات المرتبطة بالحادي عشر في الخلايا الانثويه الثديية12. ونحن كذلك الأمثل مثبطات جزيء صغير قويه لاستهداف XCIFs ، مثل ACVR1 والمستجيبين المصب من PDPK1 ، والتي بكفاءة تنشيط الحادي عشر مرتبطة Mecp2 في خطوط الخلية الخلايا الليفية ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفات [أنتونيو] [بدالوف] ل يزود الكواشف; جامعه فرجينيا نسيج الانسجه الاساسيه للحصول علي التجميد; جامعه فرجينيا تدفق الخلوية الاساسيه لتحليل تدفق الخلوي. كريستيان بلو و سالوني سينغ للحصول علي المساعدة التقنية في التنميط الجيني. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحه بحثيه مزدوجة إلى Z.Z. بشان ، وجائزه برنامج المشروع التجريبي من جامعه فرجينيا فيرجينيا للتكنولوجيا البذور جائزه الصندوق وجائزه البحوث الطبية الحيوية الفردية مؤسسه هارتويل إلى نشره سورينام
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
- Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
- Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
- Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
- Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
- Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
- Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
- Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
- Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
