Un modèle de souris non aléatoire pour la réactivation pharmacologique de Mecp2 sur le chromosome X inactif
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour générer un modèle de murin femelle viable avec l’inactivation non aléatoire de chromosome x, c.-à-d. le chromosome x maternellement hérité est inactif dans 100% des cellules. Nous décrivons également un protocole pour tester la faisabilité, la tolérabilité et la sécurité de la réactivation pharmacologique du chromosome X inactif in vivo.
Abstract
L’inactivation des chromosomes x (XCI) est le silençage aléatoire d’un chromosome X chez les femelles pour atteindre l’équilibre posologique génique entre les sexes. En conséquence, toutes les femelles sont hétérozygotes pour l’expression génique liée au X. L’un des régulateurs clés de XCI est Xist, qui est essentiel pour l’initiation et la maintenance de XCI. Des études antérieures ont permis d’identifier 13 facteurs d’inactivation des chromosomes X (XCIFs) TRANS-agissant à l’aide d’un écran génétique à grande échelle et à perte de fonction. L’inhibition des XCIFs, tels que ACVR1 et PDPK1, à l’aide d’ARN à courte épingle à cheveux ou d’inhibiteurs de petites molécules, réactive les gènes liés aux chromosomes X dans les cellules cultivées. Mais il reste à déterminer la faisabilité et la tolérabilité de la réactivation du chromosome X inactif in vivo. Vers cet objectif, un modèle de souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP a été généré avec des XCI non aléatoires en raison de la suppression de Xist sur un chromosome X. À l’aide de ce modèle, l’étendue de la réactivation X inactive a été quantitée dans le cerveau de la souris après un traitement par des inhibiteurs de la XCIF. Les résultats récemment publiés montrent, pour la première fois, que l’inhibition pharmacologique de XCIFs réactive Mecp2 du chromosome X inactif dans les neurones corticaux du cerveau de la souris vivante.
Introduction
L’inactivation des chromosomes x (XCI) est un processus de compensation de dosage qui équilibre l’expression génique liée au X en faisant taire une copie du chromosome X chez les femelles1. En conséquence, le chromosome X inactif (XI) accumule les caractéristiques caractéristiques de l’hétérochromatine, y compris la méthylation de l’ADN et les modifications inhibitrices de l’histone, telles que la triméthylation de l’histone H3-lysine 27 (H3K27me3) et l’ubiquitination de l’histone H2A (H2Aub) 2. le régulateur principal du silençage de chromosome x est la région du centre d’inactivation x (XIC), autour de 100 − 500 kb, qui contrôle le comptage et l’appariement des chromosomes x, le choix aléatoire du chromosome x pour l’inactivation, et l’initiation et propagation du silençage le long du chromosome X3. Le processus d’inactivation de X est initié par X transcription spécifique inactive (Xist) qui recouvre le XI dans CIS pour médiate le silençage à l’échelle du chromosome et remodeler la structure tridimensionnelle du chromosome x4. Récemment, plusieurs écrans protéomiques et génétiques ont identifié des régulateurs supplémentaires de XCI, tels que les protéines interdépendantes Xist 5,6,7,8,9 , le 10 , le 11 , 12. par exemple, une étude antérieure utilisant un écran d’interférence d’ARN à l’échelle du génome non biaisé a identifié 13 facteurs XCI TRANS-agissant (xcifs)12. Mécanistiquement, XCIFs réguler l’expression Xist et, par conséquent, interférer avec la fonction xcifs provoque défectueux XCI12. Ensemble, les progrès récents dans le domaine ont fourni des informations importantes sur la machinerie moléculaire qui est nécessaire pour initier et maintenir XCI.
L’identification des régulateurs XCI et la compréhension de leur mécanisme dans XCI est directement pertinente pour les maladies humaines liées aux X, comme le syndrome de Rett (RTT)13,14. La RTT est un trouble neurodéveloppemental rare provoqué par une mutation hétérozygote dans la protéine de liaison méthyl-CpG 2 (MeCP2) liée aux X qui touche principalement les filles15. Parce que MeCP2 est situé sur le chromosome X, les filles de RTT sont hétérozygotes pour la carence de MECP2 avec ~ 50% cellules exprimant le type sauvage et ~ 50% exprimant le mutant MeCP2. Notamment, les cellules mutantes RTT abritent une copie dormante mais sauvage de Mecp2 sur le XI, fournissant une source du gène fonctionnel, qui, si réactivé, pourrait potentiellement atténuer les symptômes de la maladie. En plus de la RTT, il existe plusieurs autres maladies humaines liées à X, pour lesquelles la réactivation de XI représente une approche thérapeutique potentielle, comme le syndrome de DDX3X.
L’inhibition du XCIFs, de la protéine kinase-1 (PDPK1) dépendante du 3-phosphoinositide et du récepteur de type 1 (ACVR1) de l’activine A, soit par l’ARN court en épingle à cheveux (shRNA), soit par des inhibiteurs de petites molécules, réactive les gènes liés au XI12. La réactivation pharmacologique des gènes liés au XI est observée dans divers modèles ex vivo incluant des lignées cellulaires de fibroblastes de souris, des neurones corticaux de souris adultes, des fibroblastes embryonnaires de souris et des lignées cellulaires de fibroblastes dérivées d’un patient de RTT12. Toutefois, il reste à démontrer si la réactivation pharmacologique des gènes liés au XI est réalisable in vivo. L’un des facteurs limitatifs est l’absence de modèles animaux efficaces pour mesurer avec précision l’expression des gènes du XI réactivé. Vers cet objectif, un modèle de souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP a été généré qui porte un Mecp2 génétiquement étiqueté sur XI dans toutes les cellules en raison de la suppression hétérozygote dans Xist sur le chromosome X maternel16. Utilisant ce modèle, l’expression de Mecp2 de XI a été quantitée après traitement avec des inhibiteurs de xcifs dans le cerveau des souris vivantes. Ici, la génération du modèle et de la méthodologie de la souris Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP pour quantifier la réactivation XI dans les neurones corticaux à l’aide d’essais à base d’immunofluorescence est décrite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auparavant, les XCIFs qui sont sélectivement requis pour le silençage des gènes liés au XI dans les cellules femelles de mammifères ont été identifiés12. Nous avons également optimisé les puissants inhibiteurs de petites molécules pour cibler les XCIFs, tels que les ACVR1 et les effecteurs en aval de PDPK1, qui réactivent efficacement les Mecp2 liées aux XI dans les lignées cellulaires de fibroblastes de souris, les neurones corticaux de souris et une cellule de fibroblastes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Antonio Bedalov d’avoir fourni des réactifs; Université de Virginia tissue Histology Core pour la cryosectionnement; Université de Virginie flux cytométrie de base pour l’analyse de cytométrie en flux; Christian Blue et Saloni Singh pour l’assistance technique au génotypage. Ce travail a été appuyé par une subvention de recherche double Hoo à Z.Z., et un prix du programme pilote de projet du prix de l’Université de Virginia-Virginia Tech Seed Fund et le prix de recherche biomédicale individuelle de la Fondation Hartwell à
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
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