Summary

Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

Published: May 22, 2019
doi:

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per generare un modello murino femminile vitale con inattivazione cromosomico X non casuale, cioè il cromosoma X ereditato dalla materna è inattivo nel 100% delle cellule. Descriviamo anche un protocollo per testare la fattibilità, la tollerabilità e la sicurezza della riattivazione farmacologica del cromosoma X inattivo in vivo.

Abstract

X inattivazione cromosoma (XCI) è il silenziamento casuale di un cromosoma X nelle femmine per raggiungere l’equilibrio di dosaggio genico tra i sessi. Di conseguenza, tutte le femmine sono eterozigoti per l’espressione genica legata alla X. Uno dei regolatori chiave di XCI è XIST, che è essenziale per l’avvio e la manutenzione di XCI. Studi precedenti hanno identificato 13 fattori di inattivazione del cromosoma X Trans-azione (XCIFs) utilizzando uno schermo genetico su larga scala e perdita di funzione. L’inibizione degli Xcif, come ACVR1 e PDPK1, mediante l’utilizzo di RNA a breve tornante o di piccoli inibitori delle molecole, riattiva i geni collegati al cromosoma X nelle cellule coltivate. Ma la fattibilità e la tollerabilità di riattivare il cromosoma X inattivo in vivo rimane da determinare. Verso questo obiettivo, un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP è stato generato con XCI non casuali a causa della cancellazione di XIST su un cromosoma X. Utilizzando questo modello, l’estensione della riattivazione X inattiva è stata quantitata nel cervello del topo dopo il trattamento con inibitori XCIF. I risultati recentemente pubblicati mostrano, per la prima volta, che l’inibizione farmacologica di XCIFs riattiva MECP2 dal cromosoma X inattivo nei neuroni corticali del cervello del topo vivente.

Introduction

L’inattivazione cromosoma x (XCI) è un processo di compensazione del dosaggio che bilancia l’espressione genica legata all’X silenziando una copia del cromosoma X nelle femmine1. Di conseguenza, il cromosoma X inattivo (XI) accumula le caratteristiche tipiche dell’eterocromatina, inclusa la metilazione del DNA e le modifiche dell’istone inibitorio, come l’istone H3-lisina 27 trimetilazione (H3K27me3) e l’istone H2A ubiquitinazione (H2Aub) 2. il regolatore principale del silenziamento cromosomico x è la regione del centro di inattivazione x (XIC), intorno a 100 − 500 KB, che controlla il conteggio e l’accoppiamento dei cromosomi x, la scelta casuale del cromosoma x per l’inattivazione, e l’inizio e la diffusione del silenziamento lungo il cromosoma X3. Il processo di inattivazione X è iniziato dalla trascrizione specifica X inattiva (XIST) che ricopre il XI in CIS per mediare il silenziamento a livello cromosoma e rimodellare la struttura tridimensionale del cromosoma x4. Recentemente, diversi schermi proteomici e genetici hanno identificato ulteriori regolatori di XCI, come le proteine interagenti XIST 5,6,7,8,9 , 10 il , 11 il , 12. ad esempio, uno studio precedente che utilizza uno schermo di interferenza dell’RNA a livello di genoma imparziale ha identificato 13 fattori XCI transagionanti (xcif)12. Meccanisticamente, XCIFs regolano l’espressione XIST e quindi, interferendo con la funzione xcifs provoca XCI12difettoso. Insieme, i recenti progressi nel campo hanno fornito importanti approfondimenti sui macchinari molecolari che sono necessari per avviare e mantenere XCI.

L’identificazione dei regolatori XCI e la comprensione del loro meccanismo in XCI è direttamente rilevante per le malattie dell’uomo legate all’X, come la sindrome di Rett (RTT)13,14. La RTT è un raro disturbo dello sviluppo neurologico causato da una mutazione eterozigote nella proteina 2 (MECP2) legata al metil-CPG X-linked che colpisce prevalentemente le ragazze15. Poiché MECP2 si trova sul cromosoma X, le ragazze RTT sono eterozigoti per deficit di MECP2 con ~ 50% cellule che esprimono Wild-Type e ~ 50% esprimendo MECP2mutante. In particolare, le cellule mutanti RTT porto una copia dormiente ma Wild-Type di MECP2 sul XI, fornendo una fonte del gene funzionale, che se riattivato, potrebbe potenzialmente alleviare i sintomi della malattia. Oltre alla RTT, ci sono diverse altre malattie umane legate alla X, per le quali la riattivazione di XI rappresenta un potenziale approccio terapeutico, come la sindrome DDX3X.

L’inibizione di XCIFs, 3-fosfoinositide dipendente proteina chinasi-1 (PDPK1), e activina un recettore di tipo 1 (ACVR1), sia da RNA corto (shRNA) o piccoli inibitori di molecola, riattiva geni XI-Linked12. La riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è osservata in vari modelli ex vivo che includono linee cellulari di fibroblasti del topo, neuroni corticali di topi adulti, fibromi embrionali del topo e linee cellulari di fibroblast derivate da un paziente RTT12. Tuttavia, se la riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è fattibile in vivo rimane da dimostrare. Un fattore limitante è la mancanza di modelli animali efficaci per misurare accuratamente l’espressione dei geni da riattivato XI. Verso questo obiettivo, è stato generato un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP che trasporta un MECP2 geneticamente etichettato su XI in tutte le cellule a causa dell’eliminazione eterozigote in XIST sul cromosoma X materno16. Utilizzando questo modello, l’espressione di MECP2 da XI è stata quantitata dopo il trattamento con inibitori di XCIFs nel cervello dei topi viventi. Qui è descritta la generazione del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP e la metodologia per quantificare la riattivazione di XI nei neuroni corticali utilizzando saggi basati su immunofluorescenza.

Protocol

Il lavoro che coinvolge i topi è stato approvato dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Università della Virginia (IACUC; #4112). 1. generare un modello di mouse XCI non casuale con MECP2 geneticamente etichettato su Xi Nota: Ceppi di topo utilizzati nello studio sono stati i seguenti: MECP2-GFP/MECP2-GFP (MECP2TM 3.1 uccello, tabella dei materiali) e XIST/δxist (B6; 1…

Representative Results

Per dimostrare la fattibilità del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP per gli studi di riattivazione XI, la riattivazione xcif inibitore-mediata di XI-Linked MECP2-GFP è stata testata nei fibroblasti embrionali di topo (MEFs). I MEF femminili sono stati isolati dal giorno 15,5 Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP embrioni come descritto nella sezione 3 (Figura 1a). I genotipi di Xistδ femminile: MECP2/XIST: MECP2-GFP MEFs sono st…

Discussion

In precedenza, gli Xcif che sono selettivamente necessari per il silenziamento dei geni collegati a Xi nelle cellule femminili di mammiferi sono stati identificati12. Abbiamo ulteriormente ottimizzato potenti inibitori di piccole molecole per indirizzare gli Xcif, come ACVR1 e gli effettori a valle di PDPK1, che riattivano in modo efficiente i MECP2 collegati a Xi nelle linee cellulari di fibroblasti del topo, i neuroni corticali del topo e una cellula fibroblastica umana una linea deriva…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Antonio Bedalov per aver fornito reagenti; Università di Virginia tessuto istologia nucleo per criosettioning; Università di Virginia flusso citometria nucleo per analisi di citometria a flusso; Christian Blue e saloni Singh per l’assistenza tecnica con la genotipo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca Double Hoo a Z.Z., e da un premio del programma di progetto pilota dell’Università di Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award e dal premio individuale di ricerca biomedica di Hartwell Foundation a ente

Materials

MICE
Mecp2tm3.1Bird The Jackson Laboratory #014610
B6;129-Xist (tm5Sado) provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTS
22×22 mm coverslip FISHERfinest (Fisher Scientific) 125488
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S
50 ml syringe Medline Industries NPMJD50LZ
60mm culture dish CellStar 628160
7-AAD BioLegend 420403
ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Chemical A661-3
anti-GFP-AlexaFluor647 Invitrogen A-31852
anti-MAP2 Aves Labs MAP
BSA Promega R396D
Buprenorphine SR Zoopharm
citric acid Sigma C-1857
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning Cellgro 10-013-CV
Ethanol Decon Labs 2701
fetal bovine serum (FBS) VWR Life Science 89510-198
gelatin Sigma-Aldrich G9391
glass slides Fisherbrand 22-034-486
goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody Aves Labs F-1005
GSK650394 ApexBio B1051
hamilton 10μl syringe Hamilton Sigma-Aldrich 28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14025-092
Ketamine Ketaset NDC 0856-2013-01
Large blunt/blunt curved scissors Fine Science Tools 14519-14
LDN193189 Cayman Chemicals 11802
lodixanol Sigma 1343517
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Chemical M35-212
Methylcelulose Sigma M0262-100G
mounting medium with DAPI Vectashield H-1200
Needle tip, 26 GA x 1.25" PrecisionGlide 305111
ophthalmic ointment Refresh Lacri-Lube 93468
optimal cutting temperature (O.C.T.) ThermoFisher
PCR mix
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) Corning Cellgro 46-103-CM
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P330-500
scalpel blades
Shallow glass or plastic tray
skin glue/tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
sodium azide Fisher Scientific CAS 26628-22-8
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S642-212
standard hemostat forceps Fine Science Tools 13013-14
Standard tweezers Fine Science Tools 11027-12
Straight iris scissors Fine Science Tools 14058-11
sucrose Fisher Scientific BP220-1
Tris-base Fisher Bioreagents BP152-5
Triton X-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
Xylazine Akorn NDC: 59399-111-50
EQUIPMENT
Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope Zeiss Zeiss AxioObserver
0.45mm burr IDEAL MicroDrill 67-1000
BD FACScalibur
centrifuge
glass homogenizer
cell culture incubator Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i 13-998-213
Leica 3050S research cryostat
stereotactic platform
thermocycler
Timer
ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
Water bath (37 ºC) Fisher Scientific Isotemp 2239

References

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Cite This Article
Przanowski, P., Zheng, Z., Wasko, U., Bhatnagar, S. A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (147), e59449, doi:10.3791/59449 (2019).

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