Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung eines lebensfähigen weiblichen Murinmodells mit nicht zufälliger X-Chromosomeninaktivierung, d.h. das mütterlich vererbte X-Chromosom ist in 100% der Zellen inaktiv. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Prüfung der Machbarkeit, Verträglichkeit und Sicherheit der pharmakologischen Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo.
Abstract
X-Chromosomin-Inaktivierung (XCI) ist die zufällige Abschaltung eines X-Chromosoms bei Frauen, um das Gleichgewicht zwischen den Geschlechtern zu erreichen. Damit sind alle Weibchen heterozygös für die X-gebundene Genexpression. Einer der wichtigsten Regulatoren von XCI ist Xist,der für die Initiierung und Wartung von XCI unerlässlich ist. Frühere Studien haben 13 Trans, die X-Chromosom-Inaktivierungsfaktoren (XCIFs) verwenden, anhand eines großformatigen, funktionslosen genetischen Bildschirms identifiziert. Hemmung von XCIFs, wie ACVR1 und PDPK1, mit Kurzhaarnadel-RNA oder kleinen Molekül-Inhibitoren, reaktiviert X-Chromosomen-verknüpfte Gene in kultivierten Zellen. Doch die Machbarkeit und Verträglichkeit der Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo bleibt abzuwarten. Zu diesem Zweck wurde ein Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Mausmodell mit nicht zufälligem XCI erzeugt, da Xist auf einem X-Chromosom gelöscht wurde. Mit diesem Modell wurde das Ausmaß der inaktiven X-Reaktivierung im Maushirn nach der Behandlung mit XCIF-Inhibitoren quantitiert. Vor kurzem veröffentlichte Ergebnisse zeigen erstmals, dass die pharmakologische Hemmung von XCIFs Mecp2 aus dem inaktiven X-Chromosom in kortikalen Neuronen des lebenden Maushirns reaktiviert.
Introduction
X-Chromosomen-Inaktivierung (XCI) ist ein Prozess der Dosierkompensation, der X-verknüpfte Genexpression ausgleicht, indem eine Kopie des X-Chromosoms bei Frauen1zum Schweigen gebracht wird. Das inaktive X-Chromosom (Xi) sammelt daher charakteristische Merkmale von Heterochromatin, darunter die DNA-Methylierung und hemmende Histonmodifikationen, wie die Histon-H3-Lysin 27-Trimethylation (H3K27me3) und die Histon-H2A-Ubiquitation (H2A) 2. Der Hauptregler des X-Chromosomenschliakings ist die X-Inaktivierungs-Region (Xic), etwa 100 − 500 kb, die das Zählen und Paarung der X-Chromosomen, die zufällige Wahl des X-Chromosoms für die Inaktivierung und die Initiation und Ausbreitung von Schweigen entlang des X-Chromosoms 3. Der Prozess der X-Inaktivierung wird durch X-inaktive spezifische Transkription (Xist) eingeleitet, die den Xi in cis beschichtet, um Chromosomen-Sichern zu vermitteln und die dreidimensionale Struktur des X-Chromosoms4 neu zu modellieren. In jüngster Zeit haben mehrere proteomische und genetische Bildschirme zusätzliche Regulatoren von XCI identifiziert, wie zum Beispiel Xist interagierende Proteine 5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. Zum Beispiel hat eine frühere Studie mit einem unvoreingenommenen genom-weiten RNA-Interferenzbildschirm 13 Trans-wirkende XCI-Faktoren(XCIFs) 12 identifiziert. Mechanisch regulieren XCIFs den Xist-Ausdruck und führen daher zu defekten XCI12, die die XCIFs-Funktion stören. Zusammen haben die jüngsten Fortschritte auf diesem Gebiet wichtige Einblicke in die molekularen Maschinen gegeben, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung von XCI erforderlich sind.
Die Identifizierung der XCI-Regulatoren und das Verständnis ihres Mechanismus in XCI sind für X-gebundene menschliche Krankheiten wie das Rett-Syndrom (RTT) 13,14direkt relevant. RTT ist eine seltene Neuroentwicklungsstörung, die durch eine heterozygöse Mutation im X-verknüpften Methyl-CpG-Bindungsprotein 2 (MECP2) verursacht wird, das vorwiegend Mädchen 15 betrifft. Da sich MECP2 auf dem X-Chromosom befindet, sind RTT-Mädchen heterozygös für MECP2 -Mangel mit ~ 50% Zellen, die Wild-Typ und ~ 50% Ausdruck der Mutant MECP2ausdrücken. Vor allem die RTT-Mutantzellen beherbergen eine ruhende, aber wilde Kopie von Mecp2 auf dem Xi, die eine Quelle des funktionellen Gens darstellt, das, wenn es reaktiviert wird, möglicherweise Symptome der Krankheit lindern könnte. Neben RTT gibt es noch einige andere X-gebundene menschliche Krankheiten, für die die Reaktivierung von Xi einen möglichen therapeutischen Ansatz darstellt, wie das DDX3X-Syndrom.
Hemmung von XCIFs, 3-phosphoinositid-abhängigem Protein Kinase-1 (PDPK1) und Aktivierung von A-Rezeptor Typ 1 (ACVR1), entweder durch kurze Haarnadel-RNA (shRNA) oder kleine Molekül-Inhibitoren, reaktiviert Xi-verknüpfte 12. Die pharmakologische Reaktivierung von Xi-verknüpften Genen wird in verschiedenen Ex-vivo-Modellen beobachtet, die Maus-Fischblätter-Linien, erwachsene Maus-kortikale Neuronen, Mäuse-Embryonalfibroblasten und Fibroblast-Zelllinien, die von einem RTT-Patienten12abgeleitet werden, umfassen. Ob in vivo eine pharmakologische Reaktivierung von Xi-gebundenen Genen möglich ist, bleibt jedoch abzuwarten. Ein begrenzender Faktor ist das Fehlen wirksamer Tiermodelle, um die Expression von Genen aus reaktivierten Xi genau zu messen. Zu diesem Ziel wurde ein Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Maus-Modell erstellt, das in allen Zellen ein genetisch beschriftetes Mecp2 auf Xi in allen Zellen trägt, da es im Xist auf dem mütterlichen X-Chromosom 16 eine heterozygöse Löschung gibt. Mit diesem Modell wurde der Ausdruck von Mecp2 von Xi nach der Behandlung mit XCIFs-Inhibitoren im Gehirn lebender Mäuse quantitativ behandelt. Hier wird die Generation der Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Maus-Modell und-Methodik zur Quantisierung der Xi-Recaktivierung in kortikalen Neuronen mit immunluoreszenalen Assays beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zuvor wurden XCIFs identifiziert, die selektiv für das Schweigen von Xi-verknüpften Genen in Säugetierzellen benötigt werden. Wir haben weitere potente kleine Molekül-Inhibitoren optimiert, um XCIFs, wie ACVR1 und nachgelagerte Effekte von PDPK1, die Xi-linked Mecp2 in Maus-Fischblastzelllinien, Mauskortikalneuronen und einer menschlichen Fibroblast effektiv reaktivieren Zeile abgeleitet von einem RTT-Patienten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Xi-Reaktivierung ein plausi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Antonio Bedalov für die Bereitstellung von Reagenzien; University of Virginia Tissue Histology Core for Kryosectioning; University of Virginia Flow Cytometry Core für Fließzytometrie-Analyse; Christian Blue und Saloni Singh für technische Hilfe bei der Genotypisierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Doppel-Hoo-Forschungsstipendium an Z.Z. und einen Pilot-Projektprogramm-Award von der University of Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award und den Hartwell Foundation Individual Biomedical Research Award an S.B.
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
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