Summary

Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

Published: May 22, 2019
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Summary

Aquí describimos un protocolo para generar un modelo murino femenino viable con inactivación cromosómica no aleatoria, es decir, el cromosoma X de herencia maternalmente está inactivo en el 100% de las células. También describimos un protocolo para probar la viabilidad, la tolerabilidad y la seguridad de la reactivación farmacológica del cromosoma X inactivo in vivo.

Abstract

La inactivación del cromosoma x (XCI) es el silenciamiento aleatorio de un cromosoma X en las hembras para lograr el equilibrio de dosis genéticas entre los sexos. Como resultado, todas las hembras son heterocigósas para la expresión génica ligada al X. Uno de los reguladores clave de XCI es Xist, que es esencial para el inicio y mantenimiento de XCI. Estudios previos han identificado 13 factores de inactivación cromosómica de acción trans (XCIFs) que utilizan una pantalla genética de pérdida de función a gran escala. La inhibición de XCIFs, como ACVR1 y PDPK1, mediante el uso de ARN de horquilla corta o de inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes relacionados con los cromosomas X en las células cultivadas. Pero la viabilidad y tolerabilidad de reactivar el cromosoma X inactivo in vivo queda por determinar. Hacia este objetivo, se ha generado un modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP con XCI no aleatorio debido a la eliminación de Xist en un cromosoma X. Usando este modelo, la extensión de la reactivación X inactiva fue cuantitada en el cerebro del ratón después del tratamiento con inhibidores de XCIF. Los resultados publicados recientemente muestran, por primera vez, que la inhibición farmacológica de XCIFs reactiva el Mecp2 del cromosoma X inactivo en las neuronas corticales del cerebro viviente del ratón.

Introduction

La inactivación del cromosoma x (XCI) es un proceso de compensación de dosis que equilibra la expresión génica ligada al X mediante el silenciamiento de una copia del cromosoma X en las hembras1. Como resultado, el cromosoma X inactivo (XI) acumula rasgos característicos de la heterocromatina, incluyendo la metilación del ADN y las modificaciones de la histona inhibitoria, tales como histona H3-lisina 27 trimetilación (H3K27me3) e histona H2A ubiquitinación (H2Aub) 2. el regulador maestro del silenciamiento cromosómico x es la región centro de inactivación x (XIC), alrededor de 100-500 KB, que controla el conteo y emparejamiento de los cromosomas x, la elección aleatoria del cromosoma x para la inactivación, y la iniciación y propagación del silenciamiento a lo largo del cromosoma X3. El proceso de inactivación X se inicia mediante una transcripción específica X inactiva (Xist) que recubre el XI en CIS para mediar el silenciamiento de todo el cromosoma y la remodelación de la estructura tridimensional del cromosoma X4. Recientemente, varias pantallas proteómicas y genéticas han identificado reguladores adicionales de XCI, como las proteínas de interacción Xist 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. por ejemplo, un estudio anterior que utiliza una pantalla de interferencia de ARN no sesgada de todo el genoma identificó 13 factores de XCI de acción Trans(xcifs)12. Mecaniísticamente, XCIFs regula la expresión Xist y, por lo tanto, interferir con la función xcifs causa XCI12defectuoso. En conjunto, los avances recientes en el campo han proporcionado información importante sobre la maquinaria molecular necesaria para iniciar y mantener la XCI.

La identificación de los reguladores de XCI y la comprensión de su mecanismo en XCI es directamente relevante para las enfermedades humanas vinculadas a X, como el síndrome de rett (RTT)13,14. El RTT es un trastorno raro del desarrollo neurológico causado por una mutación heterocigosa en la proteína de unión al metil-CpG 2 ligada al X (MECP2) que afecta predominantemente a las niñas15. Debido a que el MECP2 se encuentra en el cromosoma X, las niñas RTT son heterocigosas para la deficiencia de MECP2 con ~ 50% de células que expresan el tipo salvaje y ~ 50% expresan un mutante MECP2. En particular, las células mutantes RTT albergan una copia inactiva pero de tipo salvaje de Mecp2 en el XI, proporcionando una fuente del gen funcional, que si se reactiva, podría aliviar los síntomas de la enfermedad. Además del RTT, hay varias otras enfermedades humanas vinculadas al X, para las que la reactivación de XI representa un posible enfoque terapéutico, como el síndrome de DDX3X.

La inhibición de XCIFs, proteína de 3-fosfoinositida dependiente quinasa-1 (PDPK1), y Activin un receptor tipo 1 (ACVR1), ya sea por el ARN corto del pelo (shRNA) o inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes XI-vinculados12. La reactivación farmacológica de genes XI-ligados se observa en varios modelos ex vivo que incluyen líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratones adultos, fibroblastos embrionarios de ratón y líneas celulares de fibroblastos derivadas de un paciente RTT12. Sin embargo, queda por demostrar si la reactivación farmacológica de los genes vinculados con XI es factible in vivo. Un factor limitante es la falta de modelos animales efectivos para medir con precisión la expresión de los genes de la reactivada XI. Hacia este objetivo, se ha generado un Xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP que lleva un MECP2 genéticamente etiquetado en XI en todas las células debido a la deleción Heterocigosa en Xist en el cromosoma X materno16. Usando este modelo, la expresión de Mecp2 de XI se ha cuantitado después del tratamiento con inhibidores de xcifs en el cerebro de los ratones vivos. Aquí se describe la generación de xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP y metodología para la reactivación de cuantificar XI en neuronas corticales utilizando ensayos basados en inmunofluorescencia.

Protocol

El trabajo relacionado con ratones fue aprobado por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Virginia (IACUC; #4112). 1. genere un modelo de ratón XCI no aleatorio con el Mecp2 genéticamente etiquetado en XI Nota: Las cepas de ratón utilizadas en el estudio fueron las siguientes: MECP2-GFP/MECP2-GFP (MECP2TM 3.1 Bird, tabla de materiales) y Xist/δxist…

Representative Results

Para demostrar la viabilidad del modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP para estudios de reactivación XI, se probó la reactivación por inhibidor de xcif del Mecp2-GFP de XI ligado en fibroblastos embrionarios de ratones (MEFS). Las MEFs femeninas se aislaron del día 15,5 Xistδ: MECP2/Xist: embriones de MECP2-GFP como se describe en la sección 3 (figura 1A). Los genotipos de la hembra Xistδ: MECP2/Xist: los MEFS de MECP2-GFP</e…

Discussion

Anteriormente, se identificaron XCIFs que son requeridos selectivamente para el silenciamiento de genes ligados a XI en células femeninas de mamíferos12. Además, optimizamos potentes inhibidores de moléculas pequeñas para apuntar a XCIFs, como ACVR1 y efectores descendentes de PDPK1, que reactivan eficientemente el Mecp2 ligado a XI en líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratón y una célula de fibroblastos humanos línea derivada de un paciente con RT…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Antonio Bedalov por aportar reactivos; Centro de histología de tejido de la Universidad de Virginia para criseccionamiento; Núcleo de citometría de flujo de la Universidad de Virginia para análisis de citometría de flujo; Christian Blue y Saloni Singh por asistencia técnica con genotipado. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación Double Hoo a Z.Z., y un programa de proyecto piloto otorgado por el Premio de la Universidad de Virginia-Virginia Tech Seed Fund y el Premio de investigación biomédica individual de la Fundación Hartwell a S.B.

Materials

MICE
Mecp2tm3.1Bird The Jackson Laboratory #014610
B6;129-Xist (tm5Sado) provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTS
22×22 mm coverslip FISHERfinest (Fisher Scientific) 125488
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S
50 ml syringe Medline Industries NPMJD50LZ
60mm culture dish CellStar 628160
7-AAD BioLegend 420403
ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Chemical A661-3
anti-GFP-AlexaFluor647 Invitrogen A-31852
anti-MAP2 Aves Labs MAP
BSA Promega R396D
Buprenorphine SR Zoopharm
citric acid Sigma C-1857
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning Cellgro 10-013-CV
Ethanol Decon Labs 2701
fetal bovine serum (FBS) VWR Life Science 89510-198
gelatin Sigma-Aldrich G9391
glass slides Fisherbrand 22-034-486
goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody Aves Labs F-1005
GSK650394 ApexBio B1051
hamilton 10μl syringe Hamilton Sigma-Aldrich 28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14025-092
Ketamine Ketaset NDC 0856-2013-01
Large blunt/blunt curved scissors Fine Science Tools 14519-14
LDN193189 Cayman Chemicals 11802
lodixanol Sigma 1343517
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Chemical M35-212
Methylcelulose Sigma M0262-100G
mounting medium with DAPI Vectashield H-1200
Needle tip, 26 GA x 1.25" PrecisionGlide 305111
ophthalmic ointment Refresh Lacri-Lube 93468
optimal cutting temperature (O.C.T.) ThermoFisher
PCR mix
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) Corning Cellgro 46-103-CM
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P330-500
scalpel blades
Shallow glass or plastic tray
skin glue/tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
sodium azide Fisher Scientific CAS 26628-22-8
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S642-212
standard hemostat forceps Fine Science Tools 13013-14
Standard tweezers Fine Science Tools 11027-12
Straight iris scissors Fine Science Tools 14058-11
sucrose Fisher Scientific BP220-1
Tris-base Fisher Bioreagents BP152-5
Triton X-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
Xylazine Akorn NDC: 59399-111-50
EQUIPMENT
Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope Zeiss Zeiss AxioObserver
0.45mm burr IDEAL MicroDrill 67-1000
BD FACScalibur
centrifuge
glass homogenizer
cell culture incubator Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i 13-998-213
Leica 3050S research cryostat
stereotactic platform
thermocycler
Timer
ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
Water bath (37 ºC) Fisher Scientific Isotemp 2239

References

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Cite This Article
Przanowski, P., Zheng, Z., Wasko, U., Bhatnagar, S. A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (147), e59449, doi:10.3791/59449 (2019).

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