비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델
Summary
여기서, 우리는 비-랜덤 X 염색체 불 활성화와 함께 실행 가능한 여성 뮤 린 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 하 고, 즉 임산부-상속 된 X 염색체는 세포의 100%에서 불활성 이다. 우리는 또한 생체 내에서 비활성 X 염색체의 약리학 적 재 활성화의 타당성, 내성 및 안전성을 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
X 염색체 불 활성화 (XCI)는 남녀 간의 유전자 투약 균형을 달성 하기 위해 암컷에서 1 개의 X 염색체의 랜덤 침묵 이다. 결과적으로, 모든 암컷은 X-연결 유전자 발현에 대 한 이종 접합 이다. XCI의 주요 규제 기관 중 하나는 XCI의 시작과 유지 보수에 필수적인 Xist입니다. 이전 연구는 큰 규모의 기능 손실 유전 화면을 사용 하 여 13 개의 트랜스 행 X 염색체 불 활성화 인자 (XCIFs)를 확인 했습니다. ACVR1 및 PDPK1와 같은 XCIFs의 억제는 짧은 헤어핀 RNA 또는 소 분자 억제제를 사용 하 여 배양 된 세포에서 X 염색체 연결 유전자를 재 활성화 합니다. 그러나 생체 내에서 비활성 X 염색체를 재 활성화 시키는 타당성 및 내성이 결정 될 수 있다. 이 목표를 향하여, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형은 1 개의 X 염색체에 xist 의 삭제 때문에 비 랜덤 xci로 생성 되었습니다. 이 모델을 사용 하 여 비활성 X 재 활성화의 정도는 마우스 뇌에서 XCIF 억제제로 처리 된 다음에 양자화 되었다. 최근 발표 된 결과에 따르면, 처음으로 XCIFs의 약리학 적 저해는 살아있는 마우스 뇌의 대뇌 피 질의 뉴런에서의 비활성 X 염색체 로부터 Mecp2 을 재 활성화 시킨다.
Introduction
X 염색체 불 활성화 (XCI)는 x 염색체의 1 카피를 여성에 게 침묵 시켜 서 X-연결 된 유전자 발현을 균형 조정하는 투약 보상의 과정 이다. 그 결과, 비활성 X 염색체 (Xi)는 히스톤 H3-리 신 27 trimethylation (H3K27me3) 및 히스톤 H2A 유비퀴틴 화와 같은 DNA 메 틸 화 및 억제 히스톤을 포함 하는 이종 염색 질의 특징을 축적 한다 (H2Aub) 2. x 염색체 침묵의 마스터 조절기는 x 염색체의 카운팅 및 쌍을 제어 하는 약 100500kb의 x-불 활성화 센터 (Xic) 영역, 비활성화를 위한 x 염색체의 무작위 선택 및 개시 및 X 염색체를 따라 침묵의 확산3. X 불 활성화의 과정은 x 염색체 전체의 침묵을 매개 하 고 3 차원 구조를 리 모델링 하 여 ci 에 Xi를 코팅 하는 비활성 특이 적 전사체 (xist) x에 의해개시 된다. 최근에, 몇몇 프로테오 믹 및 유전 성 스크리닝은 xci,예컨대 xist 상호작용 단백질5,6,8,9 등의 추가의 조절기를 동정 하였다 , 10 , 11 , 12. 예를 들어, 이전에는 편견 된 게놈 전체의 RNA 간섭 화면을 이용 하 여 13 개 트랜스-작용 Xci 팩터 (xci)12를 확인 하였다. 기계적으로 XCIFs는 Xist 표현식을 조절 하므로 xcifs 기능을 방해 하면 결함이 있는 xcifs12가 발생 합니다. 이 분야의 최근 진보는 XCI를 시작 하 고 유지 하는 데 필요한 분자 기계에 대 한 중요 한 통찰을 제공 했습니다.
Xci 레 귤 레이 터의 식별 및이의 메커니즘을 이해 하는 것은 rett 일으키는 증후군 (RTT)13과 같은 X 연결 인간 질병과 직접적으로 관련이 있습니다. RTT는 주로 여자15에 영향을 미치는 X-결합 메 틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2)에서의 이성애 변이에 의해 발생 하는 드문 신경 발달 장애입니다. MECP2 는 X 염색체에 위치 하기 때문에, RTT 소녀는 MECP2 변이 MECP2를 발현 하는 야생 형 및 ~ 50%를 발현 하는 세포 ~ 50%의 결핍에 의존 하 고 있다. 특히, RTT 돌연변이 세포는 시 Mecp2 의 휴면 하지만 야생 형 카피를 항구에 정박 하 여, 활성화 된 경우 잠재적으로 질병의 증상을 완화 시킬 수 있는 기능적 유전자의 공급원을 제공 합니다. RTT 외에도 Xi의 재 활성화는 DDX3X 증후군과 같은 잠재적인 치료 접근법을 나타내는 여러 가지 다른 X 연결 인간 질환이 있습니다.
XCIFs의 억제, 3 phosphoinositide 의존적인 단백질 키나 제 PDPK1) 및 액티 빈 수용 체 타입 1(ACVR1), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 소 분자 억제제에 의해, Xi-연결 된 유전자를 재 활성화 시킨다12. Xi-연결 된 유전자의 약리학 적 재 활성화는 RTT 환자 (12) 로부터 유래 된 마우스 섬유 아 세포 주, 성체 마우스 피 질 뉴런, 마우스 배아 섬유 모 세포 및 섬유 모 세포 주를 포함 하는 다양 한 전 생체 모델에서 관찰 된다. 그러나, Xi에 연결 된 유전자의 약리학 적 재 활성화 여부는 생체 내에서 입증 될 수 있다. 한 가지 제한 요인은 재 활성화 된 Xi에서 유전자의 발현을 정확 하 게 측정 하는 효과적인 동물 모델의 부족 이다. 이 목표를 향하여, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형은 모계 X 염색체16에 있는 xist 에 있는 이성애에 있는 다 수 적 삭제 때문에 모든 세포에서 Xi에 유전자로 표지 된 Mecp2 를 운반 하는 생성 되었습니다. 이 모형을 사용 하 여, Xi에서 Mecp2 의 표현은 살아있는 쥐의 두뇌에 있는 xcifs 억제제를 가진 처리 다음에 정량화 되었습니다. 여기서, 상기 Xistδ의 생성은: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모델과 면역 형광 기반 분석 법을 사용 하 여 피 질 뉴런에서의 양자화 된 Xi 재 활성화 방법을 설명 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전에, 포유동물 여성 세포에서 Xi-연결 된 유전자의 침묵을 위해 선택적으로 요구 되는 XCIFs는12를 동정 하였다. 우리는 마우스 섬유 아 세포 주, 마우스 대뇌 피 질의 뉴런 및 인간 섬유 모 세포에서 Xi-연결 된 Mecp2 을 효율적으로 재 활성화 하는 PDPK1의 ACVR1 및 다운스트림 이펙터와 같은 xcifs를 대상으로 하는 강력한 소 분자 억제제를 추가로 최적화 했습니다. RTT 환자에서 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 시 약을 제공 하기 위한 안토니오 Bedalov 감사 합니다; 냉동 절편에 대 한 버지니아 조직 조직학 코어 대학; 유 세포 분석을 위한 버지니아 대학교 유 세포 분석기 코어; 크리스천 블루와 샐로 니 싱은 유전형 분석에 대 한 기술 지원을 제공 합니다. 이 작품은 Z.Z.에 더블 후 연구 보조금에 의해 지원 되었다, 및 S.B.에 대학 버지니아 테크 종자 펀드 상 및 Hartwell 재단 개별 생물 의학 연구 상에서 파일럿 프로젝트 프로그램 상 수상
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
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