Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een levensvatbare vrouwelijke muizenmodel met niet-Random X-chromosoom inactivatie, dat wil zeggen, de moederlijke erfelijke X-chromosoom is inactief in 100% van de cellen. We beschrijven ook een protocol om de haalbaarheid, tolerantie, en de veiligheid van farmacologische reactivering van het inactieve X-chromosoom in vivo te testen.
Abstract
X-chromosoom inactivatie (XCI) is de willekeurige silencing van een X-chromosoom bij vrouwen te bereiken gen dosering evenwicht tussen de geslachten. Als gevolg hiervan zijn alle vrouwen zygoot voor X-gebonden genexpressie. Een van de belangrijkste regulatoren van XCI is xist, wat essentieel is voor de initiatie en het onderhoud van XCI. Eerdere studies hebben geïdentificeerd 13 trans Acting X-chromosoom inactivatie factoren (XCIFs) met behulp van een grootschalige, verlies-of-functie genetische scherm. Remming van XCIFs, zoals ACVR1 en PDPK1, met behulp van kort haarspeld RNA of kleine molecule inhibitoren, reactiveert X chromosoom-gebonden genen in gekweekte cellen. Maar de haalbaarheid en tolerantie van het reactiveren van het inactieve X-chromosoom in vivo moet nog worden bepaald. Naar dit doel, een XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP muismodel is gegenereerd met niet-Random XCI als gevolg van schrapping van xist op een X-chromosoom. Met behulp van dit model, de omvang van inactief X reactivering werd quantitated in de muis hersenen na behandeling met XCIF remmers. Onlangs gepubliceerde resultaten tonen, voor de eerste keer, dat de farmacologische remming van XCIFs reactiveert Mecp2 van de inactieve X-chromosoom in corticale neuronen van de levende muis hersenen.
Introduction
X-chromosoom inactivatie (XCI) is een proces van dosering compensatie die X-gebonden genexpressie door silencing een kopie van het X-chromosoom in vrouwen1balanceert. Dientengevolge, accumuleert het inactieve X-chromosoom (XI) kenmerkende eigenschappen van heterochromatin met inbegrip van Methylation van DNA en remmende histone wijzigingen, zoals histone H3-lysine 27 trimethylation (H3K27me3) en histone H2A Ubiquitination (H2Aub) 2. de kapitein regulator van x-chromosoom silencing is de x-inactivatie Center (Xic) regio, ongeveer 100 − 500 KB, die het tellen en koppelen van de x-chromosomen, de willekeurige keuze van het x-chromosoom voor inactivatie controles, en de initiatie en uitspreiden van silencing langs het X-chromosoom3. Het proces van X inactivatie wordt geïnitieerd door X inactief specifieke transcriptie (xist) dat jassen de XI in CIS te bemiddelen chromosoom-brede silencing en remodelleren de driedimensionale structuur van het X-chromosoom4. Onlangs hebben verschillende Proteomic en genetische schermen geïdentificeerd extra regulatoren van XCI, zoals xist interactie eiwitten5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. bijvoorbeeld, een eerdere studie met behulp van een onbevooroordeelde genoom-Wide RNA interferentie scherm geïdentificeerd 13 trans-Acting XCI factoren (XCIFs)12. Mechanistically, XCIFs reguleren xist expressie en dus interfereren met XCIFs functie veroorzaakt defecte XCI12. Samen, hebben de recente vooruitgang op het gebied belangrijke inzichten in de moleculaire machines verstrekt die nodig zijn om XCI in werking te stellen en te handhaven.
Identificatie van XCI regulators en het begrijpen van hun mechanisme in XCI is direct relevant voor X-gebonden ziekten van de mens, zoals RETT syndroom (RTT)13,14. RTT is een zeldzame neurologische aandoening veroorzaakt door een zygoot mutatie in de X-gebonden methyl-CpG bindende proteïne 2 (MECP2) die hoofdzakelijk van invloed op meisjes15. Omdat MECP2 is gelegen op het X-CHROMOSOOM, RTT meisjes zijn zygoot voor MECP2 deficiëntie met ~ 50% cellen uitdrukken wild-type en ~ 50% uitdrukken Mutant MECP2. Met name, RTT mutantcellen Harbor een slapende maar wild-type kopie van Mecp2 op de XI, het verstrekken van een bron van het functionele gen, die, indien gereactiveerd, zou kunnen verlichten de symptomen van de ziekte. Naast RTT, zijn er verscheidene andere X-verbonden menselijke ziekten, waarvoor de reactivering van XI een potentiële therapeutische benadering, zoals DDX3X syndroom vertegenwoordigt.
Remming van XCIFs, 3-phosphoinositide afhankelijke proteïne kinase-1 (PDPK1), en activin een receptortype 1 (ACVR1), of door korte haarspeld RNA (shRNA) of kleine molecule inhibitors, reactiveert XI-verbonden genen12. Farmacologische reactivering van XI-gebonden genen wordt waargenomen in verschillende ex vivo modellen die muis fibroblast cel lijnen, volwassen muis corticale neuronen, muis embryonale fibroblasten, en fibroblast cel lijnen afgeleid van een RTT patiënt12omvatten. Echter, of farmacologische reactivering van XI-gelinkte genen haalbaar is in vivo nog moet worden aangetoond. Één beperkende factor is het gebrek aan efficiënte dierlijke modellen om de uitdrukking van genen van gereactiveerd XI nauwkeurig te meten. Naar dit doel, een XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP muismodel is gegenereerd dat draagt een genetisch gelabelde Mecp2 op XI in alle cellen als gevolg van zygoot schrapping in xist op de moeder X-chromosoom16. Gebruikend dit model, is de uitdrukking van Mecp2 van XI quantitated na behandeling met XCIFs inhibitors in de hersenen van het leven muizen geweest. Hier, de generatie van de XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP muismodel en methodologie om quantitate XI reactivering in corticale neuronen met behulp van immunofluorescentie-gebaseerde assays wordt beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerder, XCIFs die selectief worden vereist voor het silencing van XI-gelinkte genen in zoogdieren vrouwelijke cellen werden geïdentificeerd12. We verder geoptimaliseerd krachtige kleine molecule-remmers te richten XCIFs, zoals ACVR1 en downstream-effects van PDPK1, die efficiënt opnieuw activeren XI-linked Mecp2 in de muis fibroblast cel lijnen, muis corticale neuronen, en een menselijke fibroblast cel lijn afgeleid van een RTT patiënt. Deze resultaten suggereren dat XI reactivering is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Antonio Bedalov voor het verstrekken van reagentia; Universiteit van Virginia weefsel de kern van de histologie voor cryosectioning; Universiteit van Virginia flow Cytometry core voor flow Cytometry analyse; Christian Blue en de van de technische hulp bij het genotypen Singh. Dit werk werd ondersteund door een dubbele Hoo Research Grant aan Z.Z., en een pilot project programma Award van de Universiteit van Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award en de Hartwell Foundation individuele biomedische onderzoek Award aan S.B.
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
- Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
- Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
- Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
- Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
- Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
- Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
- Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
- Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
