Summary

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

Published: May 22, 2019
doi:

Summary

Burada, rastgele olmayan X kromozom inactivation ile uygulanabilir bir kadın duvar modeli oluşturmak için bir protokol tarif, yani, maternally miras X kromozom hücrelerde% 100 ‘ de aktif değildir. Ayrıca, pasif X kromozom in vivo farmakolojik reaktivasyonunun fizibilite, tolerabilite ve güvenliğini test etmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Abstract

X kromozom inaktivasyonu (XCI) cinsiyeler arasında gen dozaj dengesi elde etmek için kadınlarda bir X kromozom rasgele susturulması olduğunu. Sonuç olarak, tüm kadınlar X bağlantılı gen ifadesi için heterozigot vardır. XCı ‘nın anahtar düzenleyicilerinin biri, XCı ‘nın başlatılması ve bakımı için gerekli olan Xist‘dir. Önceki çalışmalar, büyük ölçekli, fonksiyon kaybı genetik ekranı kullanarak 13 Trans hareket X kromozom inaktivasyon faktörünü (Xcıs) tespit etmiştir. ACVR1 ve PDPK1 gibi Xcıs ‘Ler, kısa saç pim RNA veya küçük molekül inhibitörleri kullanarak inhibisyonu, kültürlü hücrelerde X kromozom bağlantılı genleri yeniden etkinleştirir. Ancak Pasif X kromozom in vivo olarak yeniden aktive edilebilirliğinin fizibilite ve tolerabilitesi belirlenecek. Bu hedefe doğru, bir Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli bir X kromozom üzerinde Xist silinmesi nedeniyle olmayan rasgele XCI ile üretilir. Bu modeli kullanarak, aktif X reaktivasyonu ölçüde XCıF inhibitörleri ile tedavi sonrasında fare beyin quantite oldu. Son zamanlarda yayımlanan sonuçları göstermek, ilk kez, Xcıfs farmakolojik inhibisyonu canlı fare beynin kortikal nöronlar içinde aktif X kromozom Mecp2 yeniden etkinleştirir.

Introduction

X kromozom inaktivasyonu (XCI) doz telafisi bir süreçtir x-bağlantılı gen ifadesi dişilerde x kromozom bir kopyasını susturarak dengeler1. Sonuç olarak, aktif olmayan X kromozom (Xi), histon H3-lizin 27 trimetilasyon (H3K27me3) ve histon H2A mayası (H2Aub) gibi DNA metilasyonu ve inhibitör histon modifikasyonları dahil heterokromatin karakteristik özelliklerini birikir 2. x kromozom susturulması Master regülatörü, x kromozomların sayım ve eşleştirme, inactivation için x kromozom rasgele seçimi ve başlama ve başlatma kontrolleri 100 − 500 KB civarında, xınactivation Merkezi (KIC) bölgedir X kromozom3boyunca susturma yayılması. X inaktivasyonu süreci, x kromozom4‘ ün üç boyutlu yapısını yeniden modellemek ve kromozom çapında susturulması için BDT ‘de bulunan XI ‘e özel transkript (xıst) tarafından başlatılır. Son zamanlarda, çeşitli proteomik ve genetik ekranlar XCI ek regülatörler tespit etti, gibi x-ist etkileşim proteinleri5,6,7,8,9 , 10 ‘ dan fazla , 11 ‘ i , 12. Örneğin, tarafsız genom çapında RNA parazit ekranı kullanan bir önceki çalışmada 13 Trans-hareket XCI faktörü (xcıs)12tespit edilmiştir. Mekanik olarak, Xcıs Xıst ifadesini düzenler ve bu nedenle xcıfs işlevine müdahale etmek arızalı XCI12‘ ye neden olur. Birlikte, alanda son gelişmeler XCı başlatmak ve korumak için gerekli olan moleküler makine içine önemli Öngörüler sağladı.

XCI regülatörlerinin tanımlanması ve XCI ‘daki mekanizmalarını anlamak Rett sendromu (RTT)13,14gibi X bağlantılı insan hastalıkları ile doğrudan ilgilidir. RTT, X-bağlantılı metil-CPG bağlayıcı protein 2 ‘ de bir heterozigot mutasyon nedeniyle nadir görülen bir nörogelişimsel hastalıktır (MECP2), ağırlıklı olarak kızları etkileyen15. MECP2 X kromozom üzerinde yer aldığından, RTT kızlar MECP2 eksikliği için heterozigot vardır ~ 50% vahşi tipi ifade hücreleri ve ~ 50% mutant MECP2ifade. Özellikle, RTT mutant hücreler bir uyuyan ama Wild-türü kopyası Mecp2 XI, fonksiyonel geni bir kaynak sağlayarak, hangi reaktive, potansiyel olarak hastalığın belirtileri hafifletmek olabilir. RTT ek olarak, Xi ‘nin yeniden aktivasyonu DDX3X sendromu gibi potansiyel bir terapötik yaklaşımın temsil ettiği diğer birçok X bağlantılı insan hastalıkları vardır.

Xcıfs inhibisyonu, 3-fosfoinositide bağımlı protein kinaz-1 (PDPK1), ve aktivin bir reseptör tipi 1 (ACVR1), kısa saç iğnesi RNA (shrna) veya küçük molekül inhibitörleri tarafından, XI bağlı genler reaktive12. XI bağlantılı genlerin farmakolojik reaktivasyonu, fare fibroblast hücre hatları, Yetişkin fare kortikal nöronlar, fare embriyonik fibroblastlar ve bir RTT hastadan elde edilen fibroblast hücre hatları içeren çeşitli ex vivo modellerde görülür12. Ancak, XI bağlantılı genlerin farmakolojik yeniden aktivasyonuna uygun olup olmadığını gösterilecektir. Bir sınırlama faktörü doğru yeniden XI genlerin ifade ölçmek için etkili hayvan modellerinin eksikliği. Bu hedefe doğru, bir xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli, maternal X kromozom16üzerinde Xist heterozigot silme nedeniyle tüm hücreler XI üzerinde bir genetik etiketli Mecp2 taşır üretilir. Bu modeli kullanarak, XI Mecp2 ifadesi, canlı farelerin beyinde Xcıfs inhibitörleri ile tedavi sonrasında quantitite edilmiştir. Burada, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli ve metodolojisi nımofluorescence tabanlı asder kullanarak kortikal nöronlar üzerinde Niceye reaktivasyonu ile tanımlanmıştır.

Protocol

Fareler ile ilgili çalışmalar Virginia Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıayuc; #4112) tarafından onaylanmıştır. 1. bir non-Random XCı fare modeli ile genetik etiketli Mecp2 XI oluşturmak Not: Çalışmada kullanılan fare suşları aşağıdaki gibidir: Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp (Mecp2TM 3.1 kuş, malzeme tablosu) ve Xist/δxist (B6; 129-Xist < tm5Sado…

Representative Results

Xistδ fizibilitesi göstermek için : Mecp2/Xıst: XI reaktivasyon çalışmaları için Mecp2-Gfp fare modeli, XI bağlantılı Mecp2-Gfp xcıf inhibitörü-aracılı reaktivasyonu fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) test edildi. Kadın MEFs gün 15,5 Xistδ: Mecp2/Xıst: Mecp2-Gfp embriyolar Bölüm 3 ‘ te açıklandığı gibi izole edildi (Şekil 1a). Dişi Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp MEFS ‘in genotipleri, daha önce<sup class="…

Discussion

Daha önce, memeliler kadın hücrelerinde XI bağlantılı genlerin susturulması için seçici olarak gerekli olan Xcıs12tespit edildi. Biz daha fazla güçlü küçük molekül inhibitörleri hedef xcıgs, ACVR1 ve PDPK1, hangi verimli Xi-bağlantılı Mecp2 fare fibroblast hücre hatları, fare kortikal nöronlar ve insan fibroblast hücre yeniden akış efektörlere gibi optimize bir RTT hasta türetilmiştir. Bu sonuçlar, XI reaktivasyonunun X bağlantılı hastalık hastalarında…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, reaktifler sağlamak için Antonio Bedalov teşekkür ederiz; Virginia Üniversitesi doku histolojisi çekirdek kriyobölümleme için; Akış sitometri analizi için Virginia Üniversitesi akış sitometri çekirdeği; Christian Blue ve Saloni Singh, genotyping ile teknik yardım için. Bu çalışma Z.Z. için bir Double Hoo araştırma Grant ve Virginia-Virginia teknoloji tohum fonu Ödülü ve Hartwell Vakfı bireysel Biyomedikal Araştırma Ödülü Üniversitesi ‘nden bir pilot proje programı Ödülü tarafından destekleniyordu SB

Materials

MICE
Mecp2tm3.1Bird The Jackson Laboratory #014610
B6;129-Xist (tm5Sado) provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTS
22×22 mm coverslip FISHERfinest (Fisher Scientific) 125488
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S
50 ml syringe Medline Industries NPMJD50LZ
60mm culture dish CellStar 628160
7-AAD BioLegend 420403
ammonium chloride (NH4Cl) Fisher Chemical A661-3
anti-GFP-AlexaFluor647 Invitrogen A-31852
anti-MAP2 Aves Labs MAP
BSA Promega R396D
Buprenorphine SR Zoopharm
citric acid Sigma C-1857
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning Cellgro 10-013-CV
Ethanol Decon Labs 2701
fetal bovine serum (FBS) VWR Life Science 89510-198
gelatin Sigma-Aldrich G9391
glass slides Fisherbrand 22-034-486
goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody Aves Labs F-1005
GSK650394 ApexBio B1051
hamilton 10μl syringe Hamilton Sigma-Aldrich 28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14025-092
Ketamine Ketaset NDC 0856-2013-01
Large blunt/blunt curved scissors Fine Science Tools 14519-14
LDN193189 Cayman Chemicals 11802
lodixanol Sigma 1343517
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Chemical M35-212
Methylcelulose Sigma M0262-100G
mounting medium with DAPI Vectashield H-1200
Needle tip, 26 GA x 1.25" PrecisionGlide 305111
ophthalmic ointment Refresh Lacri-Lube 93468
optimal cutting temperature (O.C.T.) ThermoFisher
PCR mix
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) Corning Cellgro 46-103-CM
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P330-500
scalpel blades
Shallow glass or plastic tray
skin glue/tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
sodium azide Fisher Scientific CAS 26628-22-8
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S642-212
standard hemostat forceps Fine Science Tools 13013-14
Standard tweezers Fine Science Tools 11027-12
Straight iris scissors Fine Science Tools 14058-11
sucrose Fisher Scientific BP220-1
Tris-base Fisher Bioreagents BP152-5
Triton X-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
Xylazine Akorn NDC: 59399-111-50
EQUIPMENT
Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope Zeiss Zeiss AxioObserver
0.45mm burr IDEAL MicroDrill 67-1000
BD FACScalibur
centrifuge
glass homogenizer
cell culture incubator Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i 13-998-213
Leica 3050S research cryostat
stereotactic platform
thermocycler
Timer
ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
Water bath (37 ºC) Fisher Scientific Isotemp 2239

References

  1. Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
  2. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  3. Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
  4. Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
  5. Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
  6. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  7. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
  8. Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
  9. Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
  10. Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
  11. Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
  12. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
  13. Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
  14. Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
  15. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
  16. Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
  17. Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
  18. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  19. Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Play Video

Cite This Article
Przanowski, P., Zheng, Z., Wasko, U., Bhatnagar, S. A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (147), e59449, doi:10.3791/59449 (2019).

View Video