非随机小鼠模型在非活性 X 染色体上对 Mcp2 的药理再激活
Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 以生成一个可行的女性小鼠模型与非随机 X 染色体失活, 即, 母体遗传 x 染色体是不活跃的100% 的细胞。我们还描述了一个方案, 以测试可行性, 耐受性和安全性的药理作用, 在体内的非活性 X 染色体。
Abstract
X 染色体失活 (XCI) 是女性中一个 X 染色体的随机沉默, 以实现性别之间的基因剂量平衡。因此, 所有雌性都是杂合体的 x 连锁基因表达。XCI 的关键调节器之一是xist, 这对于 xci 的启动和维护至关重要。先前的研究已经确定了13个反式作用 X 染色体失活因子 (Xcif) 使用一个大规模的, 功能丧失的基因筛选。使用短发夹 RNA 或小分子抑制剂抑制 Xcif, 如 ACVR1 和 PDPK1, 可在培养细胞中重新激活 X 染色体相关基因。但在体内重新激活不活跃 x 染色体的可行性和耐受性仍有待确定。为了实现这个目标,一个 Xisti:mcgho/xits:micp2-g夫p 小鼠模型是用非随机 xci 生成的, 因为在一个 x 染色体上删除了 xist 。利用该模型, 用 XCIF 抑制剂治疗后, 小鼠大脑中的非活性 x 再激活程度被定量。最近公布的结果表明, Xcif 的药理抑制首次从活着的小鼠大脑的皮质神经元的不活跃 x 染色体中重新激活Mep2 。
Introduction
X 染色体失活 (XCI) 是一个剂量补偿的过程, 通过沉默 x 染色体的一个副本 x 染色体在女性1平衡 x 连锁基因表达。因此, 非活性 X 染色体 (Xi) 积累了异染色质的特征特征, 包括 DNA 甲基化和抑制组蛋白修饰, 如组蛋白 H3-lysine 27 三甲基化 (H3K27me3) 和组蛋白 H2A 泛性 (H2Aub)2. x 染色体沉默的主调节器是 x 失活中心 (xic) 区域, 约 100-500kb, 控制 x 染色体的计数和配对, 随机选择 x 染色体的失活, 以及启动和启动和沿 X 染色体3号的沉默传播。X 失活的过程是由 X 不活跃的特异性转录 (xist) 启动的, 它覆盖了西在cis中, 介导全染色体的沉默, 并重新建模 x 染色体4的三维结构。最近, 一些蛋白质组和基因屏幕已经确定了 xci 的其他调节剂,如xist相互作用的蛋白质5,6,7, 8,9 ,10,11,12. 例如, 以前一项使用无偏见的全基因组 rna 干扰屏幕的研究确定了 13个反作用Xci 因素 (xcif)12。在机械上, Xcif 调节Xist 表达,因此, 干扰 xcif 功能会导致有缺陷的 xci12。该领域最近的进展共同为启动和维护 XCI 所需的分子机制提供了重要的见解。
Xci 调节剂的识别和对其在 xci 中的机制的了解与 x 连锁人类疾病直接相关, 例如 rett 综合征 (rtt)13、14。RTT 是一种罕见的神经发育障碍, 由 x 连锁甲基 cpg 结合蛋白 2 (mecp2) 中的杂合突变引起, 主要影响15岁的女孩.由于Mecp2位于 x 染色体上, RTT 女孩对Mecp2缺乏症具有杂合, 其中约50% 的细胞表达野生类型, ~ 50% 表达突变mecp2。值得注意的是, RTT 突变细胞在习近平上有一个休眠但野性的Mcp2副本, 提供了功能基因的来源, 如果重新激活, 可能会缓解这种疾病的症状。除了 RTT, 还有其他几种 x 连锁人类疾病, 其中习近平的再激活代表了一种潜在的治疗方法, 如 DDX3X 综合征。
通过短发夹 Rna (SHRNA) 或小分子抑制剂对 Xcif、3-磷酸苷依赖蛋白激酶-1 (PDPK1) 和激活蛋白 A 受体类型 1 (ACVR1) 的抑制作用, 使氧连接基因12重新激活。在各种体外模型中观察到了与氧相关基因的药理再激活, 这些模型包括小鼠成纤维细胞系、成年小鼠皮质神经元、小鼠胚胎成纤维细胞和来自 RTT 患者12的成纤维细胞系。然而, 与西有关的基因在体内的药理再激活是否可行还有待证明。一个限制因素是缺乏有效的动物模型来准确测量反应新激活后的基因表达。为了实现这个目标, 一个Xisti:mcmp2-g夫 p小鼠模型已经生成, 由于在母亲 x 染色体16上的 xist 中的杂合缺失, 在所有细胞中携带一个基因标记的 mcp2 在 xi 上. 利用该模型, 在活鼠大脑中使用Xcif 抑制剂治疗后, 对习近平 mecp2 的表达进行了定量处理。在这里, 介绍了基于免疫荧光的检测方法, 对皮质神经元中 xi 再激活进行定量的模型和方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
此前, 有选择地需要的 Xcif 对哺乳动物女性细胞中的氧连锁基因进行沉默, 结果被确定为12。我们进一步优化了针对 Xcif 的有效小分子抑制剂, 如 ACVR1 和 PDPK1 的下游效应, 它能有效地激活小鼠成纤维细胞细胞系、小鼠皮质神经元和人成纤维细胞中的氧连锁Mep2从 RTT 患者派生的行。这些结果表明, 习近平的再激活是一种可行的治疗方法, 以挽救 x 连锁疾病患者的基因缺陷;然而, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提交人感谢 Antonio Bedalov 提供试剂;弗吉尼亚大学冷冻切片组织组织组织组织组织核心;弗吉尼亚大学流式细胞术核心, 用于流式细胞术分析;Christian Blue 和 Saloni Singh 提供基因分型方面的技术援助。这项工作得到了向 z. z. 提供的双 Hoo 研究赠款、维吉尼亚大学弗吉尼亚技术种子基金奖和哈特威尔基金会个人生物医学研究奖的试点项目奖的支持。
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
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