不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル
Summary
ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X 染色体の薬理学的再活性化の可能性、忍容性及び安全性を試験するプロトコールについて述べる。
Abstract
X 染色体不活性化 (XCI) は、雌の 1 X 染色体のランダムサイレンシングで、男女間の遺伝子投薬バランスを達成する。その結果、全ての雌は X 結合遺伝子発現に対してヘテロ接合である。XCI の主要な調節因子の1つはXistであり、XCI の開始と維持に不可欠である。これまでの研究では、13のトランス作用 X 染色体の不活化因子 (XCIFs) を、大規模な機能喪失遺伝的スクリーンを用いて同定した。ACVR1 や PDPK1 などの XCIFs の阻害は、短ヘアピン RNA または低分子インヒビターを用いて、培養細胞において活性化 X 染色体結合遺伝子である。しかしインビボで不活性 X 染色体を再活性化することの実現可能性および忍容性は決定されないままである。この目的のために、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスモデルは、1つの X 染色体上のXCIの欠失により非ランダム Xist で生成されました。このモデルを用いて、不活性 X 再活性化の程度を、XCIF 阻害剤による処置後のマウス脳に定量した。最近発表された結果は、初めて、生きているマウス脳の皮質ニューロンにおける不活性 X 染色体からの XCIFs の薬理学的阻害をMecp2したことを示す。
Introduction
X 染色体不活性化 (XCI) は、女性1の x 染色体の1つのコピーをサイレンシングすることによって x 結合遺伝子発現のバランスをとった投薬補償のプロセスである。その結果、不活性 X 染色体 (Xi) は、ヒストン H3-リジン 27 trimethylation (H3K27me3) およびヒストン H2A ユビキチン化 (H2Aub) のような、DNA メチル化および阻害ヒストン修飾を含む heterochromatin の特徴的な特徴を蓄積する2. x 染色体サイレンシングのマスターレギュレータは x 不活性化センター (Xic) 領域、約100− 500 kb であり、x 染色体の計数および対形成、不活化のための x 染色体の無作為な選択、および開始およびX 染色体3に沿ったサイレンシングの広がり。X 不活性化のプロセスは、染色体全体のサイレンシングを仲介し、X 染色体4の三次元構造を改造するために、 cisで Xi を覆う x 不活性特異的転写物 (Xist) によって開始される。最近、いくつかのプロテオームおよび遺伝スクリーンは、 Xist相互作用タンパク質5、6、7、8、9などの XCI の追加のレギュレータを同定した,10,11,12.例えば、以前の研究では偏りのないゲノム全体の RNA 干渉スクリーンを用いて、13のトランス作用性 XCI 因子 (XCIFs)12を同定した。実施、XCIFs はXist発現を調節し、したがって、XCIFs 機能を妨害すると、欠損 XCI12が生じる。この分野における最近の進歩によって、XCI を開始し維持するために必要な分子機械についての重要性が理解されています。
XCI レギュレータの同定と XCI におけるそれらのメカニズムの理解は、レット症候群 (RTT)13、14などの X 結合されたヒト疾患に直接関連する。RTT は、主として女児15に影響を及ぼす X 結合メチル CpG 結合タンパク質 2 (MECP2) におけるヘテロ接合突然変異によって引き起こされる稀な神経発達障害である。MECP2は X 染色体上に位置しているため、50% の細胞が野生型を発現し、~ 50% の変異型MECP2を発現しているMECP2欠損症に対して RTT 女児がヘテロ接合である。注目すべきことに、RTT 突然変異細胞は、Xi 上でMecp2の休眠であるが野生型のコピーを提供し、活性化されればこの疾患の症状を緩和する可能性がある機能遺伝子の供給源を与える。RTT に加えて、いくつかの他の X 結合されたヒト疾患があり、そのために、Xi の再活性化は、DDX3X 症候群などの潜在的な治療的アプローチを表す。
XCIFs の阻害は、3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ− 1 (PDPK1)、およびアクチビン A 受容体タイプ 1 (ACVR1)、短いヘアピン RNA (shRNA) または小分子インヒビターによって、再活性化 Xi −連結遺伝子12による。Xi 結合遺伝子の薬理学的再活性化は、マウス線維芽細胞株、成体マウス皮質ニューロン、マウス胚性線維芽細胞、および RTT 患者12に由来する線維芽細胞株を含む様々な ex インビボモデルにおいて観察される。しかしながら、Xi 結合遺伝子の薬理学的再活性化がインビボで実現可能であるかどうかは、未だ実証されていない。1つの制限要因は、再活性化 Xi からの遺伝子の発現を正確に測定するための効果的な動物モデルの欠如である。この目的のために、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスモデルは、母体 X 染色体16に Mecp2 でヘテロ接合欠失に起因する全ての細胞において Xi に遺伝的に標識されたXistを運ぶことを生成している。このモデルを用いて、Xi からのMecp2の発現は、生きているマウスの脳内の XCIFs 阻害剤による処置に続いて定量された。ここで、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウスモデルの生成および免疫蛍光ベースのアッセイを用いた皮質ニューロンにおける Xi 再活性化を定量する方法論が記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前は、哺乳動物雌細胞において Xi 結合遺伝子のサイレンシングに選択的に必要とされている XCIFs が、12を同定した。さらに、マウス線維芽細胞株、マウス皮質ニューロン、およびヒト線維芽細胞における Xi-結合Mecp2を効率的に再活性化する PDPK1 の ACVR1 や下流エフェクターなど、XCIFs を標的とする強力な低分子阻害剤を最適化しました。RTT の患者から導かれるライ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、試薬を提供するためのアントニオ・ Bedalov に感謝します。バージニア大学 cryosectioning の組織体のコアバージニア大学フローサイトメトリーはフローサイトメトリー分析のコアです。キリスト教の青とジェノタイピングの技術支援のための Saloni シン。この作品は、Z.Z. へのダブルフー研究助成金によってサポートされていました, そして、バージニア大学-バージニア工科種子基金賞とハートウェル財団個々のバイオメディカル研究賞を S.B. にパイロットプロジェクトプログラム賞を受賞しました
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
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