מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.
Abstract
כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא אקראי השתקה של כרומוזום X אחד אצל נקבות כדי להשיג איזון המינון הגנטי בין המינים. כתוצאה מכך, כל הנקבות מheterozygous ביטוי גנטי מקושר ל-X. אחד הרגולטורים המפתח של XCI הוא Xist, אשר חיוני עבור ייזום ותחזוקה של xci. מחקרים קודמים זיהו 13 משחק טרנס כרומוזום X בכרומוזום הפעלה (XCIFs) באמצעות בקנה מידה גדול, אובדן הפונקציה של המסך הגנטי. עיכוב של XCIFs, כגון ACVR1 ו-PDPK1, באמצעות מעכבי מולקולת ה-RNA או מולקולה קטנה, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים כרומוזום X בתאים מתורבתים. אבל הכדאיות והסבילות של הפעלה מחדש של כרומוזום X לא פעיל בvivo שרידים להיקבע. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר עם xci שאינם אקראיים בשל מחיקה של xist על כרומוזום X אחד. באמצעות מודל זה, היקף ההפעלה הפעילה של X לא פעיל היה כימות במוח העכבר לאחר הטיפול עם מעכבי XCIF. תוצאות שפורסמו לאחרונה להראות, בפעם הראשונה, כי עיכוב תרופתי של XCIFs מפעיל מחדש Mecp2 מן כרומוזום X לא פעיל בנוירונים בקליפת המוח של העכבר החי.
Introduction
כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא תהליך של פיצוי המינון המאזן ביטוי גנים מקושר X על ידי השתקה עותק אחד של כרומוזום X אצל נקבות1. כתוצאה מכך, כרומוזום X לא פעיל (Xi) מצטבר תכונות אופייניות של הטרוכרוטין כולל מתילציה DNA ומעכבות שינויים היסטון, כגון היסטון H3-ליזין 27 הטריתילציה (H3K27me3) ו H2A ההיסטון (H2Aub) 2. הרגולטור הראשי של כרומוזום x השתקה הוא מרכז x-inactivation פעלה (Xic) אזור, סביב 100 לערך 500 kb, אשר שולט את הספירה ואת הזיווג של כרומוזומים X, הבחירה האקראית של כרומוזום x עבור inactivation פעלה, ואת החניכה ו הפצת שהשתקה לאורך כרומוזום X3. התהליך של הפעלת X מופעל על ידי תעתיק ספציפי X לא פעיל (Xist) כי מעילים את Xi ב- cis כדי לתווך כרומוזום-רחב השתקה לשפץ את המבנה תלת מימדי של כרומוזום X4. לאחרונה, כמה מסכי פרוטאומית וגנטית זיהו הרגולטורים נוספים של xci, כגון שישי אינטראקציה חלבונים5,6,7,8,9 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , 12. למשל, מחקר הקודם באמצעות הגנום משוחדת כלל הפרעה RNA התערבות מזוהה 13 משחק טרנסמפעל גורמי Xci (xcifs)12. מכונאי, XCIFs להסדיר ביטוי Xist ולכן, הפרעה עם הפונקציה xcifs גורם לפגום xci12. יחד, ההתקדמות האחרונה בתחום סיפקו תובנות חשובות לתוך המנגנון המולקולרי הנדרש ליזום ולתחזק XCI.
זיהוי של הרגולטורים xci והבנת המנגנון שלהם ב-xci רלוונטי ישירות למחלות אנושיות המקושרות באמצעות X, כגון תסמונת רט (rtt)13,14. RTT היא הפרעה נוירוהתפתחותית נדירה הנגרמת על ידי מוטציה heterozygous בחלבון כריכת מתיל-CpG מקושר-X 2 (MECP2) המשפיעה בעיקר על בנות15. מכיוון MECP2 ממוקם על כרומוזום X, בנות rtt הם Heterozygous עבור MECP2 מחסור עם ~ 50% תאים המבטא פראי סוג ו ~ 50% להביע MECP2מוטציה. במיוחד, RTT תאי מוטציה הנמל העתק רדום אך פראי של Mecp2 על Xi, מתן מקור של הגן הפונקציונלי, אשר אם מופעל מראש, עלול להקל על סימפטומים של המחלה. בנוסף RTT, יש כמה מחלות אחרות הקשורות ל-X, שעבורן ההפעלה החוזרת של Xi מייצגת גישה טיפולית פוטנציאלית, כגון תסמונת DDX3X.
עיכוב של XCIFs, 3-פוספהונותזול חלבון קינאז-1 (PDPK1), ופעילות מסוג קולטן 1 (ACVR1), או על ידי מעכבי מולקולה קטנה (שרין) או מולקולת מולקולות קטנות, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים Xi12. ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא נצפתה בדגמי vivo ex שונים הכוללים את העכבר לתאי הפיצוץ קווים, נוירונים למבוגרים העכבר הקליפת המין, העכבר העובריים מתחלקים, ואת קווי התאים פיברובפיצוץ נגזר מחולה RTT12. עם זאת, אם ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא אפשרי vivo שרידים להיות הפגינו. גורם מגביל אחד הוא חוסר של מודלים יעילים בעלי חיים כדי למדוד במדויק את הביטוי של גנים מופעל מראש Xi. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר כי נושאת גנטית מתויג Mecp2 על Xi בכל התאים בשל Heterozygous מחיקה ב Xist על כרומוזום X אימהי16. באמצעות מודל זה, הביטוי של Mecp2 מ Xi כבר כימות בעקבות הטיפול עם מעכבי XCIFs במוח של עכברים חיים. כאן, הדור של הXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר ומתודולוגיה כדי כימות ההפעלה הראשונה של נוירונים בקליפת הסביבה המבוססת על מבוססי immunofluorescence מבוססת מתוארת.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר, XCIFs כי הם נדרשים באופן סלקטיבי עבור השתקה של גנים מקושרים Xi בתאי נשים ביונקים זוהו12. אנחנו עוד אופטימיזציה מולקולה קטנה חזקה מעכבי כדי XCIFs היעד, כגון ACVR1 ו המורד הזרם של PDPK1, אשר ביעילות הפעלה מחדש של Xi Mecp2 בעכבר פיברוההדף קווים תא, נוירונים בקליפת העכבר, ו תא האדם פיברו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים אנטוניו בדפורלוב על מתן ריאגנטים; אוניברסיטת וירג היסטולוגיה רקמות הליבה להקפאה; האוניברסיטה של וירג זרימה Cyהליבה ליבה עבור הניתוח cy, הזרמת הזרימה; כריסטיאן בלו ו Saloni סינג לקבלת סיוע טכני עם הדפס. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק כפול מחקר Z.Z., ואת התוכנית פיילוט פרויקט פרס מאוניברסיטת וירג-וירג טק הקרן הטכנולוגי הקרן הארטבאר בודדים במחקר ביו פרס על S.B.
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
- Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
- Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
- Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
- Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
- Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
- Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
- Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
- Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
