تحليل الأحماض الدهنية المحتوى والتركيب في الطحالب الدقيقة
Summary
ووصف طريقة لتحديد محتوى الأحماض الدهنية وتكوين الطحالب في القائمة على تعطيل الميكانيكية الخلية، المذيبات استخراج الدهون مقرها، الجزيئيات التبادلي، والقياس الكمي وتحديد الأحماض الدهنية باستخدام كروماتوغرافيا الغاز. ويستخدم معيار الداخلية tripentadecanoin للتعويض عن الخسائر المحتملة خلال استخراج والجزيئيات التبادلي غير مكتملة.
Abstract
ووصف طريقة لتحديد محتوى وتكوين مجموع الأحماض الدهنية الموجودة في الطحالب. الأحماض الدهنية هي أحد المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة. ويمكن لهذه الأحماض الدهنية تكون موجودة في الطبقات أسيل الدهون المختلفة. وخاصة الأحماض الموجودة في الدهون الثلاثية (TAG) الدهنية هي من مصلحة تجارية، لأنها يمكن أن تستخدم لإنتاج أنواع وقود النقل، والمواد الكيميائية السائبة، والمغذيات (ω-3 الأحماض الدهنية)، والسلع الغذائية. لتطوير التطبيقات التجارية، وهناك حاجة إلى أساليب تحليلية موثوق بها لتقدير حجم المحتوى الأحماض الدهنية وتكوينها. الطحالب هي خلايا مفردة محاطة جدار الخلية جامدة. وينبغي أن يكون أسلوب التحليل الأحماض الدهنية تقديم تمزيق الخلايا كافية لتحرير كل الدهون أسيل وإجراءات استخراج المستخدمة يجب أن تكون قادرة على استخراج جميع الطبقات أسيل الدهون.
مع أسلوب المقدمة هنا جميع الأحماض الدهنية الموجودة في الطحالب يمكن أن يكون بدقة وبتكاثر الاتساعتعرفها وكميا باستخدام كميات صغيرة من عينة (5 ملغ) مستقلة عن طول تلك السلسلة، ودرجة التشبع، أو الطبقة الدهنية التي هي جزء من.
هذا الأسلوب لا يوفر المعلومات حول الوفرة النسبية للفئات الدهون مختلفة، ولكن يمكن أن تمتد إلى الطبقات فصل الدهون عن بعضها البعض.
ويستند أسلوب على سلسلة من اضطراب الميكانيكية الخلية، المذيبات استخراج الدهون مقرها، أسترة الأحماض الدهنية إلى استرات الأحماض الدهنية الميثيل (جوع)، وتقدير وتحديد جوع باستخدام كروماتوغرافيا الغاز (GC-FID). يتم إضافة معيار الداخلية TAG (tripentadecanoin) قبل الإجراء التحليلي لتصحيح خسائر خلال استخراج والجزيئيات التبادلي غير مكتملة.
Introduction
الأحماض الدهنية هي واحدة من المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة وجعل عادة ما بين 5-50٪ من الوزن الجاف الخلية 1-3. كانت موجودة أساسا في شكل glycerolipids. هذه glycerolipids بدورها تتكون أساسا من الدهون الفوسفاتية، السكرية، والدهون الثلاثية (TAG). وخاصة الأحماض الدهنية الموجودة في TAG هي من مصلحة تجارية، لأنها يمكن أن تستخدم كمورد لإنتاج وقود النقل، والمواد الكيميائية السائبة، والمغذيات (ω-3 الأحماض الدهنية)، والسلع الغذائية 3-6. الطحالب يمكن أن تنمو في المياه القائمة وسائل الاعلام زراعة البحر، يمكن أن يكون لها الإنتاجية المساحية أعلى بكثير من النباتات البرية، ويمكن زراعتها في photobioreactors في مواقع غير مناسبة لأغراض الزراعة، وربما حتى في الخارج. لهذه الأسباب، وغالبا ما تعتبر الطحالب بديلا واعدا للنباتات الأرضية لإنتاج وقود الديزل الحيوي وغيرها من المنتجات السائبة 3-6. لا يحتمل لتر الزراعيةوأو المياه العذبة (عندما تزرع في photobioreactors مغلقة أو عندما يتم استخدام الطحالب البحرية) وهناك حاجة لإنتاجها. وبالتالي، تعتبر الوقود الحيوي المشتق من الطحالب الدقيقة 3 الوقود الحيوي من الجيل الثالث.
مجموع المحتويات الخلوية من الأحماض الدهنية (٪ من الوزن الجاف)، وتكوين الطبقة الدهنية، وكذلك طول الأحماض الدهنية ودرجة التشبع تختلف اختلافا كبيرا بين الأنواع الطحالب. علاوة على ذلك، هذه الخصائص تختلف مع ظروف زراعة مثل توافر المواد الغذائية، ودرجة الحرارة، ودرجة الحموضة، وشدة الضوء 1،2. على سبيل المثال، عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين، يمكن أن الطحالب تتراكم كميات كبيرة من TAG. في ظل ظروف النمو المثلى TAG يشكل عادة أقل من 2٪ من الوزن الجاف، ولكن عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين المحتويات TAG يمكن أن تزيد لتصل إلى 40٪ من الوزن الجاف الطحالب الدقيقة 1.
الطحالب أساسا إنتاج الأحماض الدهنية مع أطوال سلسلة من 16 و 18يمكن ذرات الكربون، ولكن بعض الأنواع تجعل الأحماض الدهنية لمدة تصل إلى 24 ذرات الكربون في الطول. كلا المشبعة، وكذلك يتم إنتاج الأحماض الدهنية غير المشبعة كبير من قبل الطحالب. وتشمل هذه الأخيرة الأحماض الدهنية مع الفوائد الغذائية (ω-3 الأحماض الدهنية) مثل C20: 5 (حمض الدهني؛ EPA) وC22: 6 (حمض الدوكوساهيكسانويك؛ DHA) التي لا وجود لها بدائل نباتية 1،2،4،7. و(توزيع) الدهنية حمض طول السلسلة ودرجة التشبع يحدد أيضا خصائص ونوعية الوقود الحيوي المشتق من الطحالب والزيوت الصالحة للأكل 4،8.
لتطوير التطبيقات التجارية من الطحالب الدقيقة المستمدة الأحماض الدهنية، وهناك حاجة إلى أساليب تحليلية موثوق بها لتقدير حجم المحتوى الأحماض الدهنية وتكوينها.
كما أشار أيضا بها Ryckebosch وآخرون. 9، تحليل الأحماض الدهنية في الطحالب يميز نفسه عن ركائز أخرى (مثل الزيوت النباتية والمنتجات الغذائية والأنسجة الحيوانية الخ) يكونتسبب 1) هي خلايا الطحالب وحيدة الخلية محاطة بجدران صلبة، تعقيد استخراج الدهون؛ 2) الطحالب تحتوي على مجموعة متنوعة واسعة من الطبقات الشحمية وتوزيع الطبقة الدهنية متغير بدرجة كبيرة 7. هذه الفئات المختلفة الدهون دينا تشكيلة واسعة من حيث التركيب الكيميائي والخصائص مثل قطبية. أيضا، والطبقات الدهون الأخرى من الدهون أسيل يتم إنتاجها؛ 3) الطحالب تحتوي على مجموعة متنوعة واسعة من الأحماض الدهنية، والتي تتراوح 12-24 ذرات الكربون في طول وتحتوي على كل المشبعة وكذلك الأحماض الدهنية غير المشبعة عالية. لذلك، وضعت وسائل لتحليل الأحماض الدهنية في ركائز أخرى من الطحالب الدقيقة، قد لا تكون مناسبة لتحليل الأحماض الدهنية في الطحالب.
كما استعرضتها Ryckebosch وآخرون. 9، والفرق الرئيسي بين إجراءات استخراج الدهون شيوعا هو في أنظمة المذيبات التي يتم استخدامها. بسبب مجموعة كبيرة ومتنوعة من الطبقات الدهنية الموجودة في الطحالب، تختلف كل منها في قطبية، واستخراجوكمية الدهون تختلف مع المذيبات المستخدمة 10-12. وهذا يؤدي إلى عدم الاتساق في محتوى الدهون وتكوينها المعروضة في الأدب 9،10. اعتمادا على نظام المذيبات المستخدمة والأساليب القائمة على استخراج المذيبات دون انقطاع الخلية من خلال، على سبيل المثال، ضرب حبة أو صوتنة، قد لا استخراج كل الدهون بسبب بنية جامدة بعض الأنواع الطحالب 9،13. في حالة استخراج الدهون غير مكتملة، لا يمكن للكفاءة الاستخراج من الطبقات الشحمية مختلفة تختلف 14. وهذا يمكن أيضا أن يكون له تأثير على قياس تكوين الأحماض الدهنية، وذلك لأن تكوين الأحماض الدهنية غير متغير بين الطبقات الدهنية 7.
ويستند أسلوب لدينا على سلسلة من اضطراب الميكانيكية الخلية، المذيبات استخراج الدهون مقرها، أسترة الأحماض الدهنية إلى استرات الأحماض الدهنية الميثيل (جوع)، وتقدير وتحديد جوع باستخدام كروماتوغرافيا الغاز في توليفة مع ioniza اللهبكشف نشوئها (GC-FID). يتم إضافة معيار الداخلية في شكل الدهون الثلاثية (tripentadecanoin) قبل إجراء التحليل. الخسائر المحتملة خلال استخراج والجزيئيات التبادلي غير مكتملة ومن ثم يمكن تصحيح ل. طريقة يمكن استخدامها لتحديد محتوى فضلا عن تكوين الأحماض الموجودة في الكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة الدهنية. جميع الأحماض الموجودة في الطبقات الدهنية أسيل مختلفة، بما في ذلك التخزين (TAG)، وكذلك نسبة الدهون في غشاء (السكرية، الدهون الفوسفاتية)، يتم الكشف عن، حدد وكميا بدقة وبتكاثر بواسطة هذه الطريقة باستخدام كميات صغيرة فقط من عينة (5 ملغ) الدهنية . هذا الأسلوب لا يوفر المعلومات حول الوفرة النسبية للفئات الدهون المختلفة. ومع ذلك، ويمكن تمديد طريقة لفصل الطبقات الدهنية من بعضها البعض 1. تركيز وتكوين الأحماض الدهنية من الطبقات الدهنية المختلفة ومن ثم يمكن تحديد بشكل فردي.
في الأدب العديد من الطرق الأخرىوصف لتحليل الدهون في الطحالب. تركز بعض الأساليب على مجموع مكونات محبة للدهون 15، في حين تركز أساليب أخرى على مجموع الأحماض الدهنية 9،16. وتشمل هذه البدائل تقرير الجاذبية من الدهون الكلية المستخرجة، مباشرة عبر الأسترة من الأحماض الدهنية جنبا إلى جنب مع الكمي باستخدام اللوني، وتلطيخ الخلايا مع الأصباغ الفلورية محبة للدهون.
وثمة بديل استخداما لتقدير الأحماض الدهنية باستخدام اللوني هو التقدير الكمي للدهون باستخدام تقرير الجاذبية 17،18. مزايا وجود تقرير الجاذبية هي عدم وجود متطلبات لمعدات متقدمة ومكلفة مثل اللوني الغاز؛ تخفيف لإعداد الإجراء، نظرا لتوافر المعدات التحليلية موحدة (على سبيل المثال سوكسليت)؛ وتقرير الجاذبية هو أقل استهلاكا للوقت من اللوني الأساليب القائمة. والميزة الرئيسية لاستخدام أساليب اللوني استنادا إلى الغيرإيه اليد هو أنه في مثل هذا الأسلوب يتم قياس فقط الأحماض الدهنية. في تقرير الجاذبية حمض غير الدهنية التي تحتوي على الدهون، مثل الصبغات أو المنشطات، وترد أيضا في تقرير. ويمكن لهذه الأحماض الدهنية غير المحتوية على الدهون تشكل نسبة كبيرة (> 50٪) من إجمالي الدهون. إذا كان أحد لا يهتم إلا في محتوى الأحماض الدهنية (على سبيل المثال للتطبيقات وقود الديزل الحيوي)، وسوف يتم المبالغة في تقدير ذلك عند استخدام تقرير الجاذبية. بالإضافة إلى ذلك، في تقرير الجاذبية دقة التوازن التحليلية المستخدمة لوزن الدهون المستخرجة يحدد حجم العينة التي تحتاج إلى استخدامها. هذه الكمية هي عادة أكثر بكثير من المبلغ المطلوب عند استخدام اللوني. أخيرا، ميزة أخرى لاستخدام اللوني على تقرير الجاذبية هو أن اللوني يوفر معلومات حول تكوين الأحماض الدهنية.
بديل آخر لدينا وسيلة قدم هو 16،19،20 الأسترة المباشرة.في هذه الطريقة يتم الجمع بين استخراج الدهون وأسترة الأحماض الدهنية لجوع في خطوة واحدة. هذا الأسلوب هو أسرع من خطوة الاستخراج والجزيئيات التبادلي منفصلة، ولكن الجمع بين هذه الخطوات يحد من المذيبات التي يمكن استخدامها لاستخراج. وهذا قد يؤثر سلبا على كفاءة الاستخراج. ميزة أخرى لخطوة منفصلة استخراج الدهون والجزيئيات التبادلي هو أنه يتيح لفصل الطبقة الدهنية إضافية بين هذه الخطوات 1. هذا غير ممكن عند استخدام الأسترة المباشرة.
وتشمل الأساليب الأخرى المستخدمة عادة لتحديد محتوى الدهون في الطحالب تلطيخ الكتلة الحيوية مع البقع الفلورية محبة للدهون مثل النيل الأحمر أو BODIPY وقياس إشارة مضان 21،22. ميزة هذه الطرق هي أنها أقل شاقة من الطرق البديلة. والعيب من هذه الأساليب هو أن استجابة الفلورسنت، لأسباب مختلفة، بين متغير SPECIوفاق، وظروف زراعة، والطبقات الدهنية، والإجراءات التحليلية. على سبيل المثال، هي سبب العديد من هذه الاختلافات الاختلافات في امتصاص الصبغة من الطحالب. وبالتالي هناك حاجة المعايرة باستخدام طريقة أخرى الكمي، ويفضل أن يؤديها لجميع الشروط وزراعة مختلف مراحل النمو. أخيرا، هذا الأسلوب لا يوفر معلومات حول تكوين الأحماض الدهنية وأقل دقة وقابلة للتكرار من الطرق اللوني القائم.
ويستند أسلوب عرضها على طريقة وصفها امرز وآخرون 23 وسانتوس وآخرون 24 وكما تم تطبيقها من قبل مختلف الكتاب الآخرين 1،25-27. أيضا طرق أخرى المتاحة التي تقوم على نفس المبادئ ويمكن أن توفر نتائج مماثلة 9،28.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة يمكن استخدامها لتحديد محتوى وكذلك تكوين مجموع الأحماض الموجودة في الكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة الدهنية. ، تم الكشف عن الأحماض الدهنية المستمدة من جميع الطبقات الدهنية، بما في ذلك التخزين (TAG)، وكذلك نسبة الدهون في غشاء (الفوسفورية والسكرية). ويمكن…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وهناك جزء من هذا العمل كان مدعوما ماليا من قبل المعهد لتعزيز الابتكار من خلال العلوم والتكنولوجيا الاستراتيجية للبحوث الأساسية (IWT-SBO) مشروع الشمس والخلايا Biosolar. واعترف إريك أكثر جرأة وBackKim نجوين عن مساهمتها في تعظيم الاستفادة من الإجراء الضرب حبة.
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
Referências
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
- Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
- Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
- Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
- Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 89 (2), 189-198 (2011).
- Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
- Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
- Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
- Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, 75-77 (2010).
- Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
- Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
- Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
- Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
- Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
- Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing “green oil” in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
- Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
- Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
- Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
- Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
- Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
- Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
