Die Analyse der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung in Mikroalgen

Summary

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fettsäuregehalt und der Zusammensetzung in Mikroalgen anhand von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion, Umesterung und die Quantifizierung und Identifizierung der Fettsäuren mittels Gaschromatographie beschrieben. Ein tripentadecanoin interner Standard verwendet wird, um für die möglichen Verluste bei der Extraktion und unvollständiger Umesterung kompensieren.

Abstract

Ein Verfahren, um den Inhalt und die Zusammensetzung der Gesamtfettsäuren in Mikroalgen enthaltenen Säuren bestimmen beschrieben. Fettsäuren sind ein Hauptbestandteil der Mikroalgenbiomasse. Diese Fettsäuren können in verschiedenen Acyl-Lipidklassen vorhanden sein. Vor allem die in Triacylglycerol (TAG) enthaltenen Fettsäuren sind von wirtschaftlichem Interesse, da sie für die Produktion von Kraftstoffen, Massenchemikalien, Nutraceuticals (ω-3-Fettsäuren) und Nahrungsmitteln verwendet werden. Um kommerzielle Anwendungen zu entwickeln, sind verlässliche Analysemethoden zur Quantifizierung der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung benötigt. Mikroalgen sind einzelne Zellen durch eine starre Zellwand umgeben. Eine Fettsäure Analysemethode sollte ausreichend Zellaufschluss bieten alle Acyl-Lipide und das verwendete Extraktionsverfahren sollte in der Lage, alle Acyl Lipidklassen extrahieren befreien.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren alle in Mikroalgen enthaltenen Fettsäuren können genau und reproduzierbar sein idenSCHICHT und quantifiziert mit kleinen Probenmengen (5 mg), unabhängig von ihrer Kettenlänge, Unsättigungsgrad oder der Lipidklasse sie gehören.

Diese Methode liefert keine Informationen über die relative Häufigkeit der verschiedenen Lipidklassen, kann aber verlängert, um Lipidklassen voneinander zu trennen.

Das Verfahren beruht auf einer Folge von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion Umesterung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylester (FAME) sowie die Quantifizierung und Identifizierung von FAME mit Hilfe der Gaschromatographie (GC-FID) basiert. Ein TAG internen Standard (tripentadecanoin) vor dem Analyseverfahren hinzugefügt, um Verluste während der Extraktion und unvollständige Umesterung korrigieren.

Introduction

Fettsäuren sind einer der wichtigsten Bestandteile der Mikroalgen-Biomasse und machen in der Regel zwischen 5-50% der Zelltrockengewicht ^1-3. Sie sind vor allem in Form von Glycerolipide vorhanden. Diese Glycerolipiden wiederum hauptsächlich aus Phospholipiden, Glycolipiden und Triacylglycerin (TAG). Vor allem die in der TAG vorliegenden Fettsäuren von kommerziellem Interesse, weil sie als Ressource für die Produktion von Kraftstoffen, Massenchemikalien, Nutraceuticals (ω-3-Fettsäuren) und Nahrungsmittelrohstoffen ^6.3 verwendet werden. Mikroalgen in Meerwasserbasis Kultivierungsmedien wachsen, kann eine viel höhere Flächenproduktivität als Landpflanzen haben und kann in Photobioreaktoren an Standorten, die für die Landwirtschaft ungeeignet sind kultiviert werden, gegebenenfalls auch offshore. Aus diesen Gründen sind Mikroalgen oft als eine vielversprechende Alternative zu terrestrischen Pflanzen für die Herstellung von Biodiesel und anderen Schüttgütern ^3-6. Potenziell keine landwirtschaftliche lund oder Frischwasser (in geschlossenen Photobioreaktoren, wenn oder wenn kultiviert marine Mikroalgen verwendet werden) wird für ihre Herstellung benötigt wird. Daher werden Biokraftstoffen aus Mikroalgen als ^3. Generation von Biokraftstoffen.

Die gesamte zelluläre Gehalt an Fettsäuren (% Trockengewicht) der Lipidklassenzusammensetzung sowie der Fettsäure Länge und der Grad der Sättigung sehr variabel zwischen Arten von Mikroalgen. Darüber hinaus sind diese Eigenschaften variieren mit Kultivierungsbedingungen wie Nährstoffverfügbarkeit, Temperatur, pH-Wert, und die Lichtintensität ^1,2. Zum Beispiel, wenn an Stickstoffmangel ausgesetzt, Mikroalgen können große Mengen von TAG ansammeln. Unter optimalen Wachstumsbedingungen TAG stellt in der Regel weniger als 2% des Trockengewichts, aber wenn auf Stickstoffmangel TAG-Gehalt ausgesetzt sind, können bis zu 40% der Mikroalgentrockengewicht ¹ zu erhöhen.

Mikroalgen produzieren hauptsächlich Fettsäuren mit Kettenlängen von 16 und 18Kohlenstoffatomen, aber einige Arten können Fettsäuren mit bis zu 24 Kohlenstoffatomen in der Länge zu machen. Sowohl gesättigte als auch hoch ungesättigte Fettsäuren werden durch Mikroalgen. Letztere sind Fettsäuren mit ernährungsphysiologischen Vorteile (ω-3-Fettsäuren), wie C20: 5 (Eicosapentaensäure, EPA) und C22: 6 (Docosahexaensäure, DHA), für die keine pflanzlichen Alternativen gibt ^1,2,4,7. Die (Verteilung der)-Fettsäurekettenlänge und Sättigungsgrad bestimmt auch die Eigenschaften und die Qualität der Algen stamm Biokraftstoffe und Speiseöle ^4,8.

Um kommerziellen Anwendungen der Mikroalgen abgeleitet Fettsäuren zu entwickeln, sind verlässliche Analysemethoden zur Quantifizierung der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung benötigt.

Wie auch von Ryckebosch et al. ⁹ erwähnt, zeichnet sich Analyse von Fettsäuren in Mikroalgen aus anderen Substraten (zB Pflanzenöl, Nahrungsmittel, Tiergeweben etc.)Ursache 1) Mikroalgen sind einzelne Zellen durch starre Zellwand umgeben ist, verkompliziert Lipidextraktion, 2) Mikroalgen enthalten eine Vielzahl von Lipidklassen und die Lipidklassenverteilung sehr variabel ⁷ ist. Diese verschiedenen Lipidklassen eine Vielzahl der chemischen Struktur und Eigenschaften wie Polarität. Auch sind andere als Acyllipiden Lipidklassen hergestellt, 3) Mikroalgen enthalten eine Vielzahl von Fettsäuren, zwischen 12-24 Kohlenstoffatome in der Länge und die sowohl gesättigte als auch hoch ungesättigte Fettsäuren. Daher entwickelt, um Fettsäuren in anderen als Mikroalgen Substrate zu analysieren Methoden, vielleicht nicht geeignet, um Fettsäuren in Mikroalgen zu analysieren.

Wie durch Ryckebosch et al. ⁹ Bewertung ist der Hauptunterschied zwischen gängigen Lipidextraktionsverfahren in der Lösungsmittelsysteme, die verwendet werden. Aufgrund der großen Vielfalt von Mikroalgen in Gegenwart Lipidklassen, die jeweils unterschiedlicher Polarität, die extrahiertenLipid-Menge wird mit Lösungsmitteln verwendet ^10-12 variieren. Dies führt zu Inkonsistenzen in der Lipidgehalt und in der Literatur vorgestellt Zusammensetzung ^9,10. Abhängig von der verwendeten Lösungsmittelsystem, Verfahren auf der Basis der Lösungsmittelextraktion ohne Aufbrechen der Zellen durch beispielsweise Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung, nicht wegen der starren Struktur einiger Arten von Mikroalgen ^9,13 extrahieren können alle Lipide. Im Falle von unvollständigen Lipidextraktion kann die Extraktionseffizienz der verschiedenen Lipidklassen ¹⁴ variieren. Dies kann auch einen Einfluss auf das Mess Fettsäure-Zusammensetzung, da die Fettsäurezusammensetzung ist variabel zwischen Lipidklassen ^7.

Unser Verfahren basiert auf einer Sequenz von mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelbasis Lipidextraktion Umesterung von Fettsäuren zu Fettsäuremethylester (FAME) sowie die Quantifizierung und Identifizierung von FAME mittels Gaschromatographie in Kombination mit einem Flamm Ionisation basierendtion Detektor (GC-FID). Ein interner Standard in der Form einer Triacylglycerol (tripentadecanoin) vor dem Analyseverfahren aufgenommen. Mögliche Verluste bei der Extraktion und unvollständiger Umesterung kann dann korrigiert werden. Die Methode kann verwendet werden, um den Inhalt zu bestimmen sowie die Zusammensetzung der Mikroalgenbiomasse in vorhandenen Fettsäuren werden. Alle in den verschiedenen Acyl-Lipidklassen, einschließlich Speicher (TAG) als auch Membranlipide (Glykolipide, Phospholipide), erkannt werden, identifiziert und unter Verwendung von nur geringen Mengen an Probe (5 mg) durch dieses Verfahren genau und reproduzierbar zu quantifizieren vorliegenden Fettsäuren . Diese Methode liefert keine Informationen über die relative Häufigkeit der verschiedenen Lipidklassen. Jedoch kann das Verfahren erweitert werden, um Lipidklassen voneinander ¹ zu trennen. Die Konzentration und die Fettsäurezusammensetzung der verschiedenen Lipidklassen können dann individuell bestimmt werden.

In der Literatur sind mehrere andere Methodenbeschrieben, um Lipide in Mikroalgen zu analysieren. Einige Methoden konzentrieren sich auf insgesamt ¹⁵ lipophilen Bestandteile, während andere Methoden konzentrieren sich auf Gesamtfettsäuren ^9,16. Zu diesen Optionen gehören gravimetrischen Bestimmung des extrahierten Lipide, direkte Umesterung von Fettsäuren, kombiniert mit Quantifizierung mittels Chromatographie und Färben von Zellen mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Eine häufig verwendete Alternative zur Quantifizierung von Fettsäuren mittels Chromatographie ist die Quantifizierung von Lipiden mit Hilfe eines gravimetrischen Bestimmung ^17,18. Vorteile einer gravimetrischen Bestimmung sind das Fehlen von Anforderungen für fortgeschrittene und teure Ausrüstung wie ein Gaschromatograph, einfach zu, weil die Verfügbarkeit von standardisierten Analysegeräte (zB Soxhlet) einzurichten, das Verfahren, und eine gravimetrische Bestimmung ist weniger zeitaufwendig als Chromatographie basierten Verfahren. Der Hauptvorteil der Verwendung von Chromatographie basierten Verfahren auf der andeer Hand, daß bei einem solchen Verfahren nur die Fettsäuren gemessen. In einer gravimetrischen Bestimmung der Nicht-Fettsäure, Lipiden, wie Pigmente oder Steroide, werden auch in der Bestimmung enthalten. Diese nicht-Fettsäure, die Lipide bilden einen großen Anteil (> 50%) der Gesamtlipide. Wenn man nur an der Fettsäuregehalt (zB für die Biodiesel-Anwendungen) ist, wird es überbewertet, wenn eine gravimetrische Bestimmung verwendet werden. Darüber hinaus in einer gravimetrischen Bestimmung der Genauigkeit der Analysenwaage verwendet, um die extrahierten Lipide wiegen bestimmt, die Stichprobengröße, die verwendet werden muss. Diese Menge ist in der Regel weit mehr als benötigt wird, wenn die Chromatographie verwendeten Menge. Schließlich ist ein weiterer Vorteil der Verwendung von Chromatographie über gravimetrische Bestimmung, dass Chromatographie liefert Informationen über die Fettsäurezusammensetzung.

Eine weitere Alternative zu unseren vorgestellten Verfahren ist die direkte Umesterung ^16,19,20.Bei diesem Verfahren wird der Lipidextraktion und Umesterung von Fettsäuren zu FAME werden in einem Schritt zusammengefasst. Dieses Verfahren ist schneller als eine separate Extraktion und Umesterung, sondern die Kombination dieser Maßnahmen begrenzt die Lösungsmittel, die zur Extraktion verwendet werden können. Dies könnte negativ beeinflussen Extraktionseffizienz. Ein weiterer Vorteil eines separaten Lipidextraktion und Umesterung ist, dass es eine zusätzliche Lipidklassentrennung zwischen diesen Schritten ^1. Dies ist nicht möglich, wenn eine direkte Umesterung verwendet wird.

Andere häufig verwendete Methoden, um den Lipidgehalt in Mikroalgen gehören zu bestimmen Färbung der Biomasse mit lipophilen fluoreszierenden Flecken wie Nil rot oder BODIPY und die Messung der Fluoreszenzsignal ^21,22. Ein Vorteil dieser Verfahren ist, dass sie weniger aufwendig als bei anderen Methoden. Ein Nachteil dieser Verfahren ist, daß die Fluoreszenzantwort ist, die aus verschiedenen Gründen variabel zwischen Spezies, Anbaubedingungen, Lipidklassen und analytischen Verfahren. Als ein Beispiel sind einige dieser Variationen werden durch Unterschiede in der Aufnahme des Farbstoffs durch die Mikroalgen verursacht. Kalibrierung unter Verwendung einer anderen quantitativen Verfahren ist daher erforderlich, vorzugsweise für alle unterschiedlichen Anzuchtbedingungen und Wachstumsstadien durchgeführt wird. Schließlich hat dieses Verfahren keine Information über die Fettsäurezusammensetzung und ist weniger genau und reproduzierbar als Chromatographie-basierte Verfahren.

Das vorgestellte Verfahren beruht auf der von Lamers et al. ²³ und Santos et al. ²⁴ beschriebenen Methode und wurde auch von anderen Autoren ^1,25-27 angewendet. Auch andere Methoden zur Verfügung, die auf den gleichen Prinzipien basieren und könnte ähnliche Ergebnisse liefern ^9,28.

Protocol

1. Probenvorbereitung Es gibt zwei alternative Protokolle für die Probenvorbereitung enthalten wie die Schritte 1.1 und 1.2. Beide Verfahren sind gleichermaßen geeignet und ergeben ähnliche Ergebnisse, aber, wenn eine begrenzte Menge von Algen Kulturvolumen zur Verfügung steht, ist 1,1-Methode empfohlen. HINWEIS: Für beide Protokolle, bereiten zwei zusätzliche Kugelmühle Rohre nach die gesamte Protokoll, jedoch ohne Zugabe von Algen, um sie als eine leere ve…

Representative Results

Ein typisches Chromatogramm, das durch dieses Verfahren erhalten wird, ist in Fig. 1 gezeigt. FAME werden durch Größe und Grad der Sättigung durch die GC-Säule und des verwendeten Protokolls getrennt. Kürzerer Kettenlänge Fettsäuren und gesättigte Fettsäuren (weniger Doppelbindungen) kürzere Verweilzeiten. Das verwendete GC-Säule und das Protokoll nicht beabsichtigen, Fettsäure-Isomeren (gleicher Kettenlänge und Sättigungsgrad, aber unterschiedlichen Positionen der Doppelbindungen) zu tren…

Discussion

Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um den Inhalt zu bestimmen sowie die Zusammensetzung der Gesamtfettsäuren in Mikroalgen-Biomasse vorhandenen Säuren werden. Fettsäuren von allen Lipidklassen, einschließlich Speicher (TAG) als auch Membranlipide (Phospholipide und Glycolipide) abgeleitet werden erkannt. Alle Fettsäurekettenlängen und Sättigungsgrade, die in der Mikroalgen vorhanden sind, können erkannt und unterschieden werden. Das Verfahren beruht auf mechanischen Zellaufschluss, Lösungsmittelb…

Materials

Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25