Analyse van vetzuurgehalte en Compositie in Microalgen
Summary
Werkwijze voor de bepaling van vetzuren en samenstelling microalgen gebaseerd op mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering en kwantificatie en identificatie van vetzuren met gaschromatografie wordt beschreven. Een tripentadecanoin interne standaard wordt gebruikt ter compensatie van eventuele verliezen bij de winning en onvolledige omestering.
Abstract
Werkwijze om het gehalte en de samenstelling van de totale vetzuren in microalgen bepalen wordt beschreven. Vetzuren zijn een hoofdbestanddeel van microalgen biomassa. Deze vetzuren kunnen aanwezig zijn in verschillende acyl-lipiden klassen. Vooral de vetzuren in triacylglycerol (TAG) zijn commercieel belang, omdat ze kunnen worden gebruikt voor de productie van transportbrandstoffen, bulkchemicaliën, nutraceuticals (ω-3 vetzuren) en levensmiddelen. Naar commerciële toepassingen ontwikkelen, zijn betrouwbare analytische methoden voor het kwantificeren van vetzuurgehalte en samenstelling nodig. Microalgen enkele cellen omgeven door een starre celwand. Een vetzuuranalyse principe voldoende celdisruptie aan alle acyl lipiden en extractieprocedure gebruikt moeten kunnen alle acyl lipideklassen extraheren bevrijden.
Met de hier gepresenteerde methode alle vetzuren in microalgen kan nauwkeurig en reproduceerbaar zijn idenficeerd en gekwantificeerd met behulp van kleine hoeveelheden monster (5 mg) onafhankelijk van de ketenlengte, graad van onverzadigdheid of de lipide klasse ze deel uitmaken.
Deze werkwijze geeft geen informatie over de relatieve abundantie van de verschillende lipide klassen, maar kan worden uitgebreid tot lipide klassen van elkaar te scheiden.
De methode is gebaseerd op een reeks van mechanische celdisruptie, op basis van oplosmiddelen vetextractie, verestering van vetzuren aan vetzuurmethylesters (Bekendheid), en kwantificering en identificatie van Fames gebruik van gaschromatografie (GC-FID). Een TAG interne standaard (tripentadecanoin) wordt voorafgaand aan de analytische procedure toegevoegd om te corrigeren voor verliezen bij de winning en onvolledige transveresteringsreactie.
Introduction
Vetzuren zijn een van de belangrijkste bestanddelen van microalgen biomassa en maken doorgaans tussen 5-50% van de cel drooggewicht 1-3. Ze zijn voornamelijk aanwezig in de vorm van glycerolipids. Deze glycerolipids op hun beurt bestaan voornamelijk uit fosfolipiden, glycolipiden en triacylglycerol (TAG). Vooral de vetzuren aanwezig in TAG zijn commercieel belang, omdat ze kunnen worden gebruikt als een bron voor de productie van transportbrandstoffen, bulkchemicaliën, nutraceuticals (ω-3 vetzuren), en voedselproducten 3-6. Microalgen kunnen groeien in zeewater gebaseerd teelt media, kan een veel hogere productie realiseren dan landplanten hebben, en kan in fotobioreactoren worden geteeld op locaties die niet geschikt zijn voor de landbouw zijn, mogelijk zelfs uit de kust. Daarom worden microalgen vaak beschouwd als een veelbelovend alternatief voor terrestrische gewassen voor de productie van biodiesel en andere bulkproducten 3-6. Potentieel geen agrarische len of zoet water (wanneer gekweekt in gesloten fotobioreactoren of wanneer mariene microalgen worden gebruikt) is nodig voor de productie ervan. Daarom worden biobrandstoffen afkomstig van microalgen als 3 e generatie biobrandstoffen.
De totale cellulaire gehalte aan vetzuren (% droog gewicht), de lipide klasse samenstelling, alsmede het vetzuur duur en mate van verzadiging zijn zeer variabel tussen algen soorten. Bovendien, deze eigenschappen variëren kweekomstandigheden zoals nutriëntbeschikbaarheid, temperatuur, pH en lichtintensiteit 1,2. Bijvoorbeeld, wanneer blootgesteld aan stikstof honger, kan microalgen accumuleren grote hoeveelheden TAG. Onder optimale groeiomstandigheden TAG vormt typisch minder dan 2% drooggewicht, maar bij blootstelling aan stikstoftekort TAG inhoud kan oplopen tot 40% van de microalgen droog gewicht 1.
Microalgen produceren voornamelijk vetzuren met een ketenlengte van 16 en 18koolstofatomen, maar sommige soorten kunnen vetzuren tot 24 koolstofatomen lang maken. Zowel verzadigde als sterk onverzadigde vetzuren worden geproduceerd door microalgen. De laatste omvatten vetzuren met voedingswaarde (ω-3 vetzuren) als C20: 5 (eicosapentaeenzuur, EPA) en C22: 6 (docosahexaeenzuur, DHA) waarvoor geen plantaardige alternatieven bestaan 1,2,4,7. De (verdeling van) vetzuur ketenlengte en mate van verzadiging bepaalt ook de eigenschappen en kwaliteit van algen afgeleide biobrandstoffen en eetbare oliën 4,8.
Naar commerciële toepassingen van microalgen afgeleide vetzuren ontwikkelen, zijn betrouwbare analytische methoden voor het kwantificeren van vetzuurgehalte en samenstelling nodig.
Zoals ook opgemerkt door Ryckebosch et al.. 9, analyse van vetzuren in microalgen onderscheidt zich van andere substraten (bv. plantaardige olie, voedsel, dierlijk weefsel enz.) zijnveroorzaken 1) microalgen afzonderlijke cellen omgeven door rigide celwand, bemoeilijkt vetextractie, 2) algen bevatten een grote verscheidenheid van lipide klassen en het lipide klasseverdeling is zeer variabel 7. Deze verschillende lipide klassen sterk uiteenlopende chemische structuur en eigenschappen zoals polariteit. Ook andere dan acyl lipiden lipide klassen worden vervaardigd; 3) algen bevatten een grote verscheidenheid aan vetzuren, variërend 12-24 koolstofatomen lang en met zowel verzadigde als sterk onverzadigde vetzuren. Daarom ontwikkelde methoden vetzuren analyseren dan microalgen substraten, misschien geschikt vetzuren analyseren microalgen.
Zoals beoordeeld door Ryckebosch et al.. 9, het belangrijkste verschil tussen gebruikte lipide extractie procedures in het oplosmiddel-systemen worden gebruikt. Vanwege de grote variëteit aan lipide klassen die in microalgen, elk verschillend in polariteit, de geëxtraheerdelipide hoeveelheid zal variëren met de gebruikte oplosmiddelen 10-12. Dit leidt tot de inconsistenties in het vetgehalte en de samenstelling die in de literatuur 9,10. Afhankelijk van het oplosmiddelsysteem gebruikte methoden op basis oplosmiddelextractie zonder celdisruptie door bijvoorbeeld kralen kloppen of sonicatie, misschien niet extract alle lipiden door de stijve constructie van bepaalde soorten microalgen 9,13. Bij onvolledige lipide extractie, kan de extractie-efficiëntie van de verschillende lipide klassen variëren 14. Dit kan ook een effect hebben op de gemeten vetzuursamenstelling, omdat de vetzuursamenstelling varieerde tussen lipideklassen 7.
De methode is gebaseerd op een reeks mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering van vetzuren naar vetzuurmethylesters (Fames) en kwantificering en identificatie van Fames middels gaschromatografie in combinatie met een vlam ionisatietie detector (GC-FID). Een interne standaard in de vorm van een triacylglycerol (tripentadecanoin) wordt voorafgaand aan de analyseprocedure toegevoegd. Eventuele verliezen bij de winning en onvolledige transveresteringsreactie kan vervolgens worden gecorrigeerd voor. De methode kan worden gebruikt om de inhoud te bepalen alsmede de samenstelling van de vetzuren aanwezig in microalgen biomassa. Alle vetzuren in verschillende acyl-lipiden klassen, waaronder opslag (TAG) en membraan lipiden (glycolipiden, fosfolipiden), worden aangetoond, geïdentificeerd en nauwkeurig en reproduceerbaar gekwantificeerd volgens deze methode met slechts kleine hoeveelheden monster (5 mg) . Deze methode geeft geen informatie over de relatieve overvloed van verschillende lipide klassen. Echter kan de werkwijze worden uitgebreid tot lipide klassen van elkaar te scheiden 1. De concentratie en vetzuursamenstelling van de verschillende lipide klassen kunnen vervolgens individueel bepaald.
In de literatuur zijn verschillende andere methodenbeschreven lipiden analyseren microalgen. Sommige methoden richten zich op de totale lipofiele componenten 15, terwijl andere methodes richten zich op de totale vetzuren 9,16. Tot deze alternatieven behoren gravimetrische bepaling van het totaal geëxtraheerde lipiden, rechtstreekse trans-verestering van vetzuren in combinatie met kwantificering met behulp van chromatografie, en kleuren van cellen met lipofiele fluorescerende kleurstoffen.
Een veelgebruikt alternatief voor kwantificatie van vetzuren middels chromatografie kwantificering van lipiden met behulp van een gravimetrische bepaling 17,18. Voordelen van een gravimetrische bepaling zijn het gebrek aan eisen voor geavanceerde en dure apparatuur zoals een gaschromatograaf, gemakkelijk om het opzetten van de procedure, vanwege de beschikbaarheid van gestandaardiseerde analytische apparatuur (bijv. Soxhlet), en een gravimetrische bepaling is minder tijdrovend dan chromatografie gebaseerde methoden. Het grote voordeel van het gebruik van chromatografie gebaseerde werkwijzen de OTHER hand dat een dergelijke methode alleen de vetzuren gemeten. Bij een gravimetrische bepaling de niet-vetzuur bevat lipiden, zoals pigmenten of steroïden, zijn ook opgenomen in de bepaling. Deze niet-vetzuur bevat lipiden kan maken een groot deel (> 50%) van de totale lipiden. Als men in het vetzuurgehalte (bijvoorbeeld voor biodiesel toepassingen) alleen geïnteresseerd, zal worden overschat als een gravimetrische bepaling wordt gebruikt. Bovendien, in een gravimetrische bepaling van de nauwkeurigheid van de analyse wordt gebruikt om het geëxtraheerde lipiden wegen bepaalt de steekproefomvang die moet worden gebruikt. Deze hoeveelheid is meestal veel meer dan hetgeen nodig bij chromatografie gebruikt. Een laatste voordeel van het gebruik van kolomchromatografie over gravimetrisch bepaald dat chromatografie geeft informaties vetzuursamenstelling.
Een ander alternatief voor onze onderhavige methode is directe omestering 16,19,20.Bij deze werkwijze lipide extractie en transesterificatie van vetzuren Bekendheid worden gecombineerd in een stap. Deze werkwijze is sneller dan een aparte extractie en verestering stap, maar deze stappen gecombineerd beperkt de oplosmiddelen die kunnen worden gebruikt voor de extractie. Dit kan een negatieve invloed extractie-efficiëntie. Een ander voordeel van een afzonderlijke lipide extractie en omestering stap is dat het zorgt voor een extra lipideklasse scheiding tussen deze stappen 1. Dit is niet mogelijk wanneer directe transesterificatie wordt gebruikt.
Andere veel gebruikte methoden om het vetgehalte van microalgen bepalen omvatten het kleuren van de biomassa lipofiele fluorescente vlekken zoals Nile rood of BODIPY en meten van de fluorescentie signaal 21,22. Een voordeel van deze werkwijzen is dat ze minder arbeidsintensief dan alternatieve methoden. Een nadeel van deze werkwijzen is dat de fluorescente respons, om verschillende redenen, variabel tussen species, teeltomstandigheden, lipideklassen en analytische procedures. Als voorbeeld, enkele van deze variaties worden veroorzaakt door verschillen in opname van de kleurstof door de microalgen. Kalibratie met een andere kwantitatieve methode is daarom noodzakelijk, bij voorkeur uitgevoerd voor alle verschillende teeltomstandigheden en groeistadia. Tenslotte is deze methode niet informaties vetzuursamenstelling leveren en minder nauwkeurig en reproduceerbaar dan chromatografie gebaseerde methoden.
De onderhavige methode is gebaseerd op de door Lamers et al.. 23 en Santos et al.. 24 werkwijze en is ook door verschillende andere auteurs 1,25-27 toegepast. Ook andere methoden zijn beschikbaar die gebaseerd zijn op dezelfde principes en kon vergelijkbare resultaten 9,28 verschaffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven werkwijze kan worden gebruikt om de inhoud te bepalen alsmede de samenstelling van de totale vetzuren in microalgen biomassa. Vetzuren van alle lipide klassen, waaronder opslag (TAG) en membraanlipiden (fosfolipiden en glycolipiden), gedetecteerd. Alle vetzuur ketenlengtes en mate van verzadiging die in de microalgen kan worden gedetecteerd en onderscheiden. De methode is gebaseerd op mechanische celdisruptie, oplosmiddelhoudende vetextractie, verestering van vetzuren Bekendheid en kwantificering van Fames…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Een deel van dit werk werd financieel ondersteund door het Instituut voor de Aanmoediging van Innovatie door Wetenschap en Technologie-Strategisch Basisonderzoek (IWT-SBO) project Zonlicht en BioSolar Cells. Erik Bolder en BackKim Nguyen worden bedankt voor hun bijdrage aan de optimalisering van de kraal kloppend procedure.
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
Referências
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
- Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
- Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
- Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
- Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 89 (2), 189-198 (2011).
- Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
- Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
- Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
- Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, 75-77 (2010).
- Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
- Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
- Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
- Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
- Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
- Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing “green oil” in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
- Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
- Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
- Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
- Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
- Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
- Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
