微細藻類中の脂肪酸含量および組成の分析

Summary

機械的な細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、エステル交換、および定量化およびガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸の同定に基づく微細藻類中の脂肪酸含量および組成の決定のための方法が記載されている。 tripentadecanoin内部標準抽出及び不完全なエステル交換時の損失の可能性を補償するために使用される。

Abstract

微細藻類中に存在する全脂肪酸含量および組成を決定するための方法が記載されている。脂肪酸は、微細藻類バイオマスの主成分である。これらの脂肪酸は、異なるアシル脂質クラスに存在することができる。それらは輸送燃料、バルク化学品、栄養補助食品（ω-3脂肪酸）、および食料品の製造に使用することができるので、特にトリアシルグリセロール（TAG）中に存在する脂肪酸は、商業的関心がある。商業的なアプリケーションを開発するには、脂肪酸含量および組成物の定量のための信頼性のある分析方法が必要とされている。微細藻類は、剛性の細胞壁で囲まれた単一細胞である。脂肪酸分析法はすべて、アシル脂質および使用される抽出手順は、すべてのアシル脂質クラスを抽出することができる必要が遊離させるのに十分な細胞破壊を提供すべきである。

ここで紹介する方法では微細藻類中に存在するすべての脂肪酸は、正確かつ再現性のiDENすることができますtifiedおよびそれらが一部である試料の少量（5mg）を、それらの鎖長とは無関係に、不飽和度、又は脂質クラスを使用して定量した。

この方法は、異なる脂質クラスの相対量に関する情報を提供しないが、互いに脂質クラスを分離するために拡張することができる。

この方法は、機械的細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、脂肪酸メチルエステル（FAME）への脂肪酸のエステル交換、および定量化およびガスクロマトグラフィー（GC-FID）を用いて、脂肪酸メチルエステルの同定配列に基づいている。 TAG内部標準（tripentadecanoin）を抽出し、不完全なエステル交換時の損失を補正するために、分析手順の前に添加される。

Introduction

脂肪酸は、微細藻類バイオマスの主要構成成分の一つであり、典型的には細胞乾燥重量^1〜3 5〜50％の間を構成する。彼らは主にグリセロ脂質の形で存在する。順番にこれらのグリセロ脂質は、主にリン脂質、糖脂質、およびトリアシルグリセロール（TAG）で構成されています。それらは輸送燃料、バルク化学品、栄養補助食品（ω-3脂肪酸）、および食料品^3-6の製造のための資源として使用することができるため、特にTAGに存在する脂肪酸は、商業的関心がある。微細藻類は、海水基づく培養培地中で増殖することができる陸生植物よりもはるかに高い面積生産性を有することができ、おそらくはオフショア、農業に適していない箇所にフォトバイオリアクターで培養することができる。これらの理由のために、微細藻類は、多くの場合、バイオディーゼルおよび他のバルク生成物^3-6の製造のための陸生植物に対する有望な代替手段と考えられている。潜在的に何農業リットルません及び又は新鮮な水を（閉鎖フォトバイオリアクターで培養または海洋微細藻類が使用されるときの場合）、それらの製造のために必要とされる。そのため、微細藻類由来し、バイオ燃料は、 ^第 3世代のバイオ燃料と考えられている。

脂肪酸（乾燥重量％）、脂質クラス組成物、ならびに脂肪酸の長さおよび飽和度の合計含有量は、微細藻類の細胞種間で高度に可変である。さらに、これらの特性は、栄養素利用性、温度、pH、光強度^1,2培養条件によって変化する。窒素飢餓にさらされたときに、例えば、微細藻類はTAGを大量に蓄積することができる。最適な増殖条件下TAGは、典型的には、乾燥重量の2％未満を構成するが、窒素飢餓TAG含有量にさらされたときに、微細藻類の乾燥重量¹の最大40％まで増加させることができる。

微細藻類は、主に16および18の鎖長を有する脂肪酸を生産炭素原子が、いくつかの種は、最大24個の炭素原子の脂肪酸を作ることができる。高度不飽和脂肪酸は、微細藻類により産生されるように両方、ならびに飽和。 6（ドコサヘキサエン酸、DHA）は野菜の選択肢が^1,2,4,7の存在しないいる。し、C22 5（EPAエイコサペンタエン酸）：後者はC20のような栄養の利点（ω-3脂肪酸）との脂肪酸が含まれる。脂肪酸鎖長および飽和度（分布）は、藻類由来のバイオ燃料および食用油^、4,8の特性および品質を決定する。

微細藻類由来の脂肪酸の商業的なアプリケーションを開発するには、脂肪酸含量および組成物の定量のための信頼性のある分析方法が必要とされている。

またRyckebosch らにより指摘された^。9、微細藻類中の脂肪酸の分析は、他の基質（ 例えば、植物油、食品、動物組織など）と一線を画したようである原因1）微細藻類脂質抽出を複雑化、剛性の細胞壁で囲まれた単一細胞であり、2）微細藻類は、脂質クラスは、多種多様を含み、脂質クラスの分布は⁷非常に可変である。これらの異なる脂質クラスは、以下の化学構造および極性等の特性が多種多様を有する。また、アシル脂質以外の脂質クラスが生成される、3）微細藻類は、長さが12〜24個の炭素原子の範囲および飽和並びに高度不飽和脂肪酸の両方を含む、脂肪酸の多種多様を含む。従って、微細藻類以外の基板に脂肪酸を分析するために開発された方法は、微細藻類中の脂肪酸を分析するのに適しないかもしれない。

Ryckebosch ら ⁹によって検討したように、一般に使用される脂質抽出手順の主な違いは、使用される溶媒系である。そのため微細藻類に存在する脂質クラスの大規模な様々な、それぞれの極性が異なる、抽出された脂質量は^{、10月12日}に使用溶媒によって変化します。これは文献^9,10に示した脂質含量および組成が矛盾につながる。使用する溶媒系、例えば、ビーズビーティングまたは超音波処理を通じて細胞破壊することなく、溶媒抽出に基づく方法に応じて、いくつかの理由微細藻類種^9,13の剛構造の全ての脂質を抽出しない場合があります。不完全な脂質抽出の場合には、異なる脂質クラスの抽出効率が^14を変化させることができる。脂肪酸組成は、脂質クラス⁷の間で可変であるので、これはまた、測定された脂肪酸組成に影響を及ぼし得る。

我々の方法は、機械的細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、脂肪酸メチルエステル（FAME）への脂肪酸のエステル交換、および定量化及び難ionizaと組み合わせたガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸メチルエステルの同定配列に基づいているTiONから検出器（GC-FID）。トリアシルグリセロール（tripentadecanoin）の形で内部標準を前に分析手順に追加されます。抽出と不完全なエステル交換中の注意損失はその後のために補正することが可能となる。この方法は、コンテンツだけでなく、微細藻類バイオマス中に存在する脂肪酸の​​組成を決定するために使用することができる。ストレージ（TAG）並びに膜脂質（糖脂質、リン脂質）を含む異なるアシル – 脂質クラスに存在する全ての脂肪酸は、検出、同定し、試料のごく少量（5 mg）を使用して、この方法により、正確かつ再現可能に定量する。この方法は、異なる脂質クラスの相対量に関する情報を提供していません。しかしながら、この方法は、互いに¹から^の脂質クラスを分離するために拡張することができる。異なる脂質クラスの濃度および脂肪酸組成物は、次いで、個別に決定することができる。

文献に他のいくつかの方法があります微細藻類中の脂質を分析するために記載。他の方法は、全脂肪酸^9,16に焦点を当て、一方、いくつかの方法は、親油性成分の総¹⁵に焦点を当てる。これらの選択肢は、総抽出した脂質の重量測定、クロマトグラフィーを用いて定量化と組み合わせた脂肪酸の直接エステル交換、及び親油性の蛍光色素で染色した細胞が含まれています。

クロマトグラフィーを用いて脂肪酸の定量に一般的に使用される代替案は、重量測定^17,18を用いた脂質の定量化である。なぜなら、標準化された分析装置（ 例えばソックスレー）の利用可能性、プロシージャを設定するために緩和する。、重量測定の利点としては、ガスクロマトグラフなどの高度で高価な装置のための必要条件の欠如であり、重量測定は、より少ない時間のかかるよりもクロマトグラフィーに基づく方法。 OTHのクロマトグラフィーに基づく方法を使用することの主な利点小胞体の手がこのような方法では脂肪酸のみを測定することである。重量測定中の脂質を含有する非脂肪酸は、顔料またはステロイドのように、また決定に含まれている。これらの非脂肪酸含有脂質は総脂質の大部分（> 50％）を構成することができます。一つは（バイオディーゼル用途のためなど）、脂肪酸含量のみに関心がある場合、重量測定を用いた場合には、過大評価されるであろう。また、重量測定で抽出された脂質を計量するために使用される化学天秤の精度を使用する必要があるサンプルサイズを決定する。この量は、典型的にはクロマトグラフィーを用いた場合に必要な量よりもはるかに多くなる。最後に、重量測定でのクロマトグラフィーを使用することの別の利点は、クロマトグラフィーは、脂肪酸組成に関する情報を提供することである。

私たちの提示方法を別の方法としては、直接のエステル交換^16,19,20です。この方法でのFAMEへの脂質抽出と脂肪酸のエステル交換は、1つの工程で合成される。このメソッドは、別の抽出とエステル交換ステップよりも迅速であるが、これらのステップを組み合わせて抽出に用いることができる溶媒が制限されます。これは、負に抽出効率に影響を与える可能性がある。別個の脂質抽出およびエステル交換工程の別の利点は、これらのステップ¹との間に追加の脂質クラスの分離を可能にすることである。直接エステル交換反応を使用した場合、これは不可能である。

微細藻類の脂質含量を決定するためのその他の一般的に使用される方法は、ナイルなどの親油性の蛍光染色剤で染色バイオマスを含む赤色またはBODIPY蛍光シグナル^を測定する^21,22。これらの方法の利点は、それらが別の方法よりも面倒であることである。これらの方法の欠点は、蛍光応答は、様々な理由のために、仕様の間で可変であることであるES、栽培条件、脂質クラス、および分析手順。一例として、これらの変化のいくつかは、微細藻類による色素の取り込みの差によって引き起こされる。別の定量法を用いたキャリブレーションは、したがって、好ましくは、すべての異なる栽培条件や成長段階に行わ、必要とされている。最後に、この方法は、脂肪酸組成についての情報を提供し、クロマトグラフィーに基づく方法よりも正確かつ再現可能ではありません。

提示された方法は、Lamers ら ²³及びサントスら ²⁴によって記載された方法に基づいており、また、様々な他の著者^1,25-27によって適用されてきた。他の方法は、同じ原理に基づいてその利用可能であり、同様の結果^を提供すること^ができる^9,28。

Protocol

1。試料調製 1.1および1.2のステップとして、サンプル調製のための代替プロトコルが含まれる2つがあります。どちらの方法も同様に適しており、同様の結果を与えるが、藻類培養容量の限られた量が利用可能な場合は、この方法1.1が推奨されます。 NOTE：プロトコルのいずれかは、全体のプロトコルに従ってつの追加ビーズビーターチューブを調製、…

Representative Results

このプロセスを介して得られる典型的なクロマトグラムを図1に示す。 FAMEを用いるGCカラムおよびプロトコルによって、彩度の大きさ及び程度によって分離されている。短い鎖長脂肪酸およびそれ以上の飽和脂肪酸（より少ない二重結合）より短い保持時間を有する。使用されるGCカラムおよびプロトコルは、脂肪酸異性体（同じ鎖長および飽和度が、二重結合の位置が異なる）?…

Discussion

記載された方法は、コンテンツだけでなく、微細藻類バイオマス中に存在する全脂肪酸の組成を決定するために使用することができる。ストレージ（TAG）並びに膜脂質（リン脂質および糖脂質）を含むすべての脂質クラス由来の脂肪酸が検出される。微細藻類中に存在する全ての飽和脂肪酸鎖長および程度を検出し、区別することができる。この方法は、機械的細胞破壊、溶媒ベースの脂質?…

Materials

Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25