미세 조류의 지방산 콘텐츠 및 조성 분석
Summary
기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 식별에 기초하여 미세 조류의 지방산 함량 및 조성의 결정을위한 방법을 설명한다. tripentadecanoin 내부 표준 물질은 추출과 불완전 에스테르 교환시 가능한 손실을 보상하기 위해 사용된다.
Abstract
미세 조류에 존재하는 전체 지방산의 함량 및 조성을 결정하는 방법을 설명한다. 지방산은 미세 조류 바이오 매스의 주성분이다. 이러한 지방산은 다른 아실 지질 클래스에 존재할 수있다. 그들은 연료 수송, 벌크 화학 물질, 기능 식품 (ω-3 지방산), 식품 상품의 제조에 이용 될 수 있기 때문에 특히 트리 아실 글리세롤 (TAG)에 존재하는 지방산, 상업적인 관심사이다. 상용 응용 프로그램을 개발하려면, 지방산 함량과 성분의 정량화를위한 신뢰할 수있는 분석 방법이 필요합니다. 미세 조류는 단단한 세포벽에 둘러싸여 하나의 세포입니다. 지방산 분석 방법은 모두 아실 지질 및 사용한 추출 조작은 모두 아실 지질 클래스를 추출 할 수 있어야 해방 충분한 세포 분열을 제공한다.
방법은 여기에 제시된으로 미세 조류에있는 모든 지방산은 척수 문제 또는 신경관 정확하고 재현성이 될 수 있습니다tified 그들의 사슬 길이, 불포화도 또는 지질 클래스가 속하는 무관 샘플 소량 (5 mg)을 사용하여 정량.
이 방법은 다른 지질 클래스의 상대적인 풍부함에 대한 정보를 제공하지 않지만, 서로 지질 클래스를 구분하기 위해 확장 될 수있다.
방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 지방산 메틸 에스테르 (장의 이미지)으로 지방산의 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피 (GC-FID)를 사용하여 장의 이미지의 식별 시퀀스에 기초한다. TAG 내부 표준 (tripentadecanoin)는 추출과 불완전 에스테르 교환시 손실을 수정하기 전에 분석 절차에 추가됩니다.
Introduction
지방산은 미세 조류 바이오 매스의 주요 성분 중 하나이며, 일반적으로 세포 건조 중량 1-3 5~50% 사이에 만들 수 있습니다. 그들은 glycerolipids의 형태로 주로 존재한다. 차례로 이러한 glycerolipids는 주로 인지질, 당지질, 및 트리 아실 글리세롤 (TAG)로 구성되어 있습니다. 그들은 연료 수송, 벌크 화학 물질, 기능 식품 (ω-3 지방산), 및 음식 재화 3-6의 제조 자원으로 이용 될 수 있기 때문에 특히 TAG 존재 지방산은 상업적 관심이다. 미세 조류는 바다 수중 재배 미디어에서 성장할 수있는 육상 식물보다 훨씬 높은 면적 생산성을 가질 수 있으며, 어쩌면 해양, 농업에 적합하지 위치에 광 바이오 반응기에서 재배 할 수있다. 이러한 이유로, 미세 조류는 종종 바이오 디젤 및 기타 벌크 제품 3-6의 생산을위한 육상 식물에 유망한 대안으로 간주됩니다. 잠재적으로 더 농업 L 없습니다및 또는 신선한 물 (폐쇄 광 바이오 반응기하거나 재배 할 때 해양 미세 조류를 사용하는)가 자신의 생산을 위해 필요합니다. 따라서, 미세 조류 유래 바이오 연료는 제 3 세대 바이오 연료로 간주됩니다.
지방산 (건조 중량 %), 지질 수준의 조성물뿐만 아니라 지방산 길이와 포화도의 전체 셀룰러 함량은 미세 조류 종 사이에서 매우 가변적이다. 또한, 이러한 속성은 영양 가용성, 온도, pH, 그리고 빛의 세기 1, 2 등의 재배 조건에 따라 달라집니다. 질소 기아에 노출 될 때, 예를 들면, 미세 조류는 TAG 대량 축적 할 수있다. 최적의 성장 조건 하에서 TAG 전형적 건조 중량의 2 % 미만을 구성하지만, 질소 기아 TAG 컨텐츠에 노출 될 경우 미세 조류 건조 중량 1의 최대 40 %까지 증가 할 수있다.
미세 조류는 주로 16 및 18의 사슬 길이를 갖는 지방산을 생산탄소수 있지만, 일부 종은 최대 24 개의 탄소 원자의 지방산을 만들 수있다. 고도 불포화 지방산은 미세 조류에 의해 생성 된 바와 둘뿐만 아니라 포화. 6 (도코 사 헥사 엔 산, DHA)에는 야채의 대안이 1,2,4,7가 존재하지 않은 : 그리고 C22 5 (EPA 에이코 사 펜타 엔 산) : 후자는 C20과 같은 영양 혜택 (ω-3 지방산)과 지방산을 포함한다. 지방산의 사슬 길이와 포화도 (배포)도 조류 유래 바이오 연료 및 식용유 4.8의 특성과 품질을 결정합니다.
미세 조류 유래 지방산의 상용 응용 프로그램을 개발하려면, 지방산 함량과 성분의 정량화를위한 신뢰할 수있는 분석 방법이 필요합니다.
로서도 Ryckebosch 외. 9 지적한, 미세 조류의 지방산의 분석 (예를 들어 식물유, 식품, 기타 동물 조직)이 될 다른 기판으로부터 자신을 구별원인 1) 미세 조류는 지질 추출 복잡해 강성 세포벽에 의해 둘러싸여 단셀 있으며 2) 미세 조류는 지질 클래스의 다양한 포함하고 지질 수준의 분포는 7 매우 가변적이다. 이러한 다양한 지질 클래스는 화학 구조와 같은 극성 등의 속성에 다양한 있습니다. 또한, 아실 지질 이외의 지질 클래스가 생성된다, 3) 미세 조류의 길이는 12-24 탄소 원자에 이르기까지 모두 포화 등의 고도의 불포화 지방산을 포함하는 지방산의 다양한 포함. 따라서, 미세 조류 이외의 기판에 지방산을 분석하기 위해 개발 된 방법은 미세 조류의 지방산을 분석하기에 적합하지 않을 수 있습니다.
Ryckebosch 외. 구함으로써 평가에 일반적으로 사용되는 지질 추출 절차 사이의 주요 차이는 사용되는 용매 시스템에있다. 때문에 미세 조류에 존재하는 지질 클래스의 많은 종류의, 각각의 극성이 다른, 추출지질의 양이 10 ~ 12 사용하는 용매에 따라 달라질 것입니다. 이것은 지질 함량 및 조성 문학 9,10 제시의 불일치로 연결됩니다. 사용 된 용매 시스템에 따라 전지를 통해 중단없이 용매 추출에 따라 방법은, 예를 들어, 구슬 박동이나 초음파, 때문에 일부 미세 조류 종 9,13의 견고한 구조의 모든 지질을 추출 할 수 있습니다. 불완전 지질 추출의 경우, 다른 지질 클래스의 추출 효율은 14 변할 수있다. 지방산 조성은 지질 클래스 7 구비 변수 때문에이 또한 측정 된 지방산 조성에 영향을 미칠 수있다.
우리의 방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 지방산 메틸 에스테르 (장의 이미지)으로 지방산의 에스테르 교환 및 정량화 및 불꽃 ioniza와 함께 가스 크로마토 그래피를 사용하여 장의 이미지의 식별 시퀀스에 기초기의 검출기 (GC-FID). 트리 아실 글리세롤 (tripentadecanoin)의 형태로 내부 표준이 종래의 분석 과정에 추가된다. 추출 및 불완전 에스테르 교환 반응 중에 발생 가능한 손실은 보정 할 수 있습니다. 상기 방법은 콘텐츠를 결정할뿐만 아니라, 미세 조류 바이오 매스에 존재 지방산 조성하는데 사용될 수있다. 저장 (TAG)를 포함뿐만 아니라 세포막 지질 (당지질, 인지질), 감지, 샘플 만 소량 (5 mg)을 사용하여 식별이 방법으로 정확하고 재현성있게 정량 다른 아실 지질 클래스에있는 모든 지방산 . 이 방법은 다른 지질 클래스의 상대적인 풍부함에 대한 정보를 제공하지 않는다. 그러나,이 방법은 서로 다른 (1)로부터 지질 클래스를 구분하기 위해 확장 될 수있다. 다른 지질 클래스의 농도 및 지방산 조성은 개별적으로 결정될 수있다.
문헌에 여러 가지 다른 방법이 있습니다미세 조류의 지질을 분석하는 기술. 다른 방법은 전체 지방산 9,16에 초점 반면 일부 방법은, 총 친 유성 성분 15에 초점을 맞 춥니 다. 이러한 대안은 총 추출 된 지질의 중량 측정 결정, 크로마토 그래피를 사용하여 정량과 함께 지방산의 직접 에스테르 교환 반응 및 친 유성 형광 염료로 염색 세포를 포함한다.
크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 정량화에 일반적으로 사용되는 다른 방법은 중력 판정 17,18을 이용하여 지질의 정량화이다. 때문에 표준화 된 분석 장비 (예 슬렛)의 가용성, 프로 시저를 설정하는 용이함;; 중력 판정의 이점은 가스 크로마토 그래프와 같은 고급 및 고가의 장비에 대한 요구의 부재이며 중력 판정은 덜 시간 소모적보다는 크로마토 그래피 방법을 기반으로. OTH 크로마토 기반 방법을 사용하는 주요 장점ER 손 같은 방법 만 지방산가 측정된다는 것이다. 중력 판정 안료 또는 스테로이드와 같은 지질을 포함하는 비 – 지방산은 또한 판정에 포함된다. 이러한 비 지방산 함유 지질 총 지질의 큰 비율 (> 50 %)을 만들 수 있습니다. 하나 (바이오 디젤 애플리케이션을위한 예를 들어) 지방산 콘텐츠에만 관심이 있다면 중력 판정을 사용할 때, 과대 평가 될 것이다. 또, 중력 판정에서 추출한 지질 무게 데 분석 저울의 정확도가 사용될 필요 샘플 크기를 결정한다. 이 양은 일반적으로 크로마토 그래피를 사용할 때 필요한 양보다 훨씬 더. 마지막으로, 중력 판정상의 크로마토 그래피를 사용하는 또 다른 장점은 크로마토 그래피 지방산 조성에 대한 정보를 제공한다는 것이다.
우리의 제시 방법에 대한 또 다른 대안은 직접 에스테르 교환 16,19,20입니다.이 방법에서는 장의 이미지로 지질 추출 및 지방산의 에스테르 교환은 하나의 단계에서 결합된다. 이 방법은 별도의 추출 및 에스테르 교환 반응 단계보다 빠르지 만, 이들 단계를 조합하여 추출을 위해 사용될 수있는 용매를 제한한다. 이는 부정적인 추출 효율에 영향을 미칠 수있다. 별도의 지질 추출 및 에스테르 교환 반응 단계의 또 다른 장점은이 단계 (1) 사이 추가적인 지질 클래스 분리를 허용한다는 것이다. 직접 에스테르 교환 반응을 사용하는 경우에는 취소가 불가능합니다.
미세 조류의 지질 함량을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 나일과 같은 친 유성 형광 얼룩 바이오 매스 염색 포함 빨간색 또는 BODIPY 및 형광 신호 (21, 22)를 측정. 이 방법의 장점은 다른 방법보다 힘든 점이다. 이러한 방법의 단점은 형광 반응은 여러 가지 이유이며, 변수 시험편 사이이다ES, 재배 조건, 지질 클래스 및 분석 절차. 예로서, 이러한 변형은 여러 미세 조류에 의해 색소의 흡수 차이에 기인한다. 다른 방법을 사용하여 정량 보정 따라서 바람직 모든 다른 배양 조건 및 성장 단계 동안 수행 필요하다. 마지막으로,이 방법은 지방산 조성에 대한 정보를 제공하고 크로마토 그래피 기반의 방법보다 정확하고 재현 할 수 없습니다.
제시된 방법은 LAMERS 외. 23 산토스 등. (24)에 의해 설명 된 방법에 근거하고 또한 다양한 다른 저자 1,25-27 의해 적용되었다. 또 다른 방법은 동일한 원리를 기반으로하는 사용할 수 있으며, 유사한 결과 9,28를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
한 방법은 콘텐츠를 결정할뿐만 아니라, 미세 조류 바이오 매스에서 본 전체 지방산의 조성하는데 사용될 수있다. 저장 (TAG)를 포함뿐만 아니라 세포막 지질 (인지질 및 당지질) 모든 지질 클래스에서 파생 된 지방산, 검출된다. 미세 조류에 존재하는 모든 포화 지방산 사슬 길이와 각도를 검출하고 구별 될 수있다. 방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출 장의 이미지에 지방산의 에스테르 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품의 일부는 재정적으로 과학 기술 – 전략적 기초 연구 (IWT-SBO) 프로젝트 햇빛과 생체 태양 전지에 의한 혁신의 추진 연구소에 의해 지원되었다. 에릭 과감하고 BackKim 구엔은 비드 박동 절차의 최적화에 기여에 대한 인정합니다.
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
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