Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas
Summary
Un método para la determinación del contenido de ácido graso y la composición en microalgas basado en disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, de transesterificación, y la cuantificación e identificación de los ácidos grasos utilizando cromatografía de gases se describe. Un estándar interno tripentadecanoin se utiliza para compensar las posibles pérdidas durante la extracción y la transesterificación incompleta.
Abstract
Un método para determinar el contenido y la composición de ácidos grasos totales presentes en microalgas se describe. Los ácidos grasos son un componente importante de la biomasa de microalgas. Estos ácidos grasos pueden estar presentes en diferentes clases-acilo de los lípidos. Especialmente los ácidos grasos presentes en los triglicéridos (TAG) son de interés comercial, ya que pueden ser utilizados para la producción de combustibles para el transporte, los productos químicos a granel, nutracéuticos (ácidos grasos ω-3), y los productos alimenticios. Para desarrollar aplicaciones comerciales, se necesitan métodos analíticos fiables para la cuantificación del contenido de ácidos grasos y la composición. Las microalgas son células individuales rodeadas por una pared celular rígida. Un método de análisis de ácidos grasos debe proporcionar suficiente disrupción celular para liberar todos los lípidos de acilo y el procedimiento de extracción utilizado debe ser capaz de extraer todas las clases de lípidos acilo.
Con el método presentado aquí todos los ácidos grasos presentes en microalgas pueden ser precisa y reproducible idennotificada y cuantificado usando pequeñas cantidades de muestra (5 mg) independientes de su longitud de cadena, grado de insaturación, o la clase de lípidos que son parte de.
Este método no proporciona información sobre la abundancia relativa de las diferentes clases de lípidos, pero se puede ampliar para separar clases de lípidos entre sí.
El método se basa en una secuencia de disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, transesterificación de los ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), y la cuantificación e identificación de FAME, usando la cromatografía de gases (GC-FID). Una norma interna TAG (tripentadecanoin) se añade antes del procedimiento analítico para corregir las pérdidas durante la extracción y transesterificación incompleta.
Introduction
Los ácidos grasos son uno de los principales constituyentes de biomasa de microalgas y típicamente constituyen entre 5-50% del peso seco celular 1-3. Ellos son principalmente presente en la forma de glicerolípidos. Estos, a su vez glicerolípidos consisten principalmente en fosfolípidos, glicolípidos y triacilglicerol (TAG). Especialmente los ácidos grasos presentes en TAG son de interés comercial, debido a que pueden ser utilizados como un recurso para la producción de combustibles para el transporte, productos químicos a granel, nutracéuticos (ácidos grasos ω-3), y los productos alimenticios 3-6. Las microalgas pueden crecer en medios de cultivo a base de agua de mar, puede tener una productividad mucho más alta de área de las plantas terrestres, y puede ser cultivada en fotobiorreactores en lugares que no son aptos para la agricultura, posiblemente, incluso en alta mar. Por estas razones, las microalgas se consideran a menudo una alternativa prometedora a las plantas terrestres para la producción de biodiesel y otros productos a granel 6.3. Potencialmente no l agrícolay o agua dulce es necesaria para su producción (cuando se cultiva en fotobiorreactores cerrados o cuando se utilizan las microalgas marinas). Por lo tanto, los biocombustibles derivados de las microalgas se consideran biocombustibles 3 ª generación.
El contenido celular total de ácidos grasos (% de peso seco), la composición de clase de lípidos, así como la longitud de los ácidos grasos y el grado de saturación son muy variable entre las especies de microalgas. Además, estas propiedades varían con las condiciones de cultivo, tales como la disponibilidad de nutrientes, temperatura, pH, intensidad de la luz y 1,2. Por ejemplo, cuando se expone a la inanición de nitrógeno, las microalgas pueden acumular grandes cantidades de TAG. En condiciones óptimas de crecimiento TAG constituye típicamente menos de 2% de peso seco, pero cuando se expone a la inanición de nitrógeno contenido de la etiqueta puede aumentar hasta el 40% del peso seco de microalgas 1.
Las microalgas producen principalmente ácidos grasos con longitudes de cadena de 16 y 18átomos de carbono, pero algunas especies pueden hacer que los ácidos grasos de hasta 24 átomos de carbono de longitud. Tanto saturada, así como ácidos grasos altamente insaturados son producidos por microalgas. Estos últimos incluyen los ácidos grasos con beneficios nutricionales (ácidos grasos ω-3) como C20: 5 (ácido eicosapentaenoico, EPA) y C22: 6 (ácido docosahexaenoico, DHA) para los que no existen alternativas vegetales 1,2,4,7. El (distribución de) ácidos grasos de longitud de cadena y grado de saturación también determina las propiedades y la calidad de los biocombustibles derivados de algas y aceites comestibles 4,8.
Para desarrollar aplicaciones comerciales de los ácidos grasos de microalgas derivada, se necesitan métodos analíticos fiables para la cuantificación del contenido de ácidos grasos y la composición.
Como también se ha señalado Ryckebosch et al. 9, el análisis de los ácidos grasos en las microalgas se distingue de otros sustratos (por ejemplo, aceite vegetal, productos alimenticios, tejidos animales, etc) sercausar 1) microalgas son células individuales rodeadas por paredes celulares rígidas, lo que complica la extracción de lípidos; 2) microalgas contienen una amplia variedad de clases de lípidos y la distribución de clases de lípidos es muy variable 7. Estas diferentes clases de lípidos tienen una amplia variedad en la estructura química y las propiedades tales como la polaridad. Además, se producen otras clases de lípidos que los lípidos acilo; 3) microalgas contienen una amplia variedad de ácidos grasos, que van desde 12 hasta 24 átomos de carbono de longitud y que contiene tanto saturados, así como ácidos grasos altamente insaturados. Por lo tanto, los métodos desarrollados para analizar ácidos grasos en sustratos distintos de microalgas, podrían no ser adecuados para analizar los ácidos grasos en microalgas.
Como revisado por Ryckebosch et al. 9, la principal diferencia entre los procedimientos de extracción de lípidos de uso común es en los sistemas de disolventes que se utilizan. Debido a la gran variedad de clases de lípidos presentes en microalgas, cada uno que varía en la polaridad, la extraídacantidad de lípidos variará con disolventes utilizados 10-12. Esto lleva a las inconsistencias en el contenido de lípidos y la composición se presenta en 9,10 literatura. Dependiendo del sistema disolvente utilizado, los métodos basados en extracción con disolventes y sin interrupción de la célula a través de, por ejemplo, latidos del grano o sonicación, podrían no extraer todos los lípidos debido a la estructura rígida de algunas especies de microalgas 9,13. En el caso de la extracción de lípidos incompleta, la eficacia de la extracción de las diferentes clases de lípidos puede variar 14. Esto también puede tener un efecto sobre la composición de ácidos grasos medido, porque la composición de ácidos grasos es variable entre las clases de lípidos 7.
Nuestro método se basa en una secuencia de disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, transesterificación de los ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), y la cuantificación e identificación de FAME utilizando cromatografía de gases en combinación con una ionización de llamadetector ción (GC-FID). Un patrón interno en la forma de triglicéridos (tripentadecanoin) se añade antes del procedimiento analítico. Las posibles pérdidas durante la extracción y transesterificación incompleta pueden ser corregidos para. El método puede ser utilizado para determinar el contenido, así como la composición de los ácidos grasos presentes en la biomasa de microalgas. Todos los ácidos grasos presentes en las diferentes clases-acilo de los lípidos, incluido el almacenamiento (TAG), así como los lípidos de membrana (glicolípidos, fosfolípidos), son detectados, identificados y cuantificados con precisión y de forma reproducible por este método usando sólo pequeñas cantidades de muestra (5 mg) . Este método no proporciona información sobre la abundancia relativa de las diferentes clases de lípidos. Sin embargo, el método se puede ampliar para separar clases de lípidos entre sí 1. La composición de ácidos grasos y la concentración de las diferentes clases de lípidos se puede determinar individualmente.
En la literatura varios otros métodos sondescrito para analizar los lípidos en microalgas. Algunos métodos se centran en componentes lipofílicos total de 15, mientras que otros métodos se centran en los ácidos grasos totales 9,16. Estas alternativas incluyen la determinación gravimétrica del total de lípidos extraídos, trans-esterificación directa de los ácidos grasos combinados con la cuantificación mediante cromatografía y tinción de las células con tintes fluorescentes lipofílicos.
Una alternativa comúnmente utilizado para la cuantificación de ácidos grasos, usando la cromatografía es la cuantificación de los lípidos utilizando una determinación gravimétrica 17,18. Ventajas de una determinación gravimétrica son la falta de requisitos para el equipo avanzado y caro como un cromatógrafo de gases, la facilidad para establecer el procedimiento, debido a la disponibilidad de aparatos de análisis estandarizado (por ejemplo Soxhlet), y una determinación gravimétrica es menos tiempo que la cromatografía de métodos basados en. La principal ventaja de la utilización de métodos de cromatografía basado en la OTHER mano es que en un procedimiento de este tipo sólo se miden los ácidos grasos. En una determinación gravimétrica del ácido no graso que contiene lípidos, como los pigmentos o los esteroides, también se incluyen en la determinación. Estos lípidos de ácido no graso que contiene pueden constituir una gran proporción (> 50%) de los lípidos totales. Si uno está interesado sólo en el contenido de ácidos grasos (por ejemplo, para aplicaciones de biodiesel), se sobreestimó cuando se utiliza una determinación gravimétrica. Además, en una determinación gravimétrica la exactitud de la balanza analítica utilizada para pesar los lípidos extraídos determina el tamaño de la muestra que debe ser utilizado. Esta cantidad es típicamente mucho más de la cantidad necesaria cuando se utiliza cromatografía. Por último, otra de las ventajas de la utilización de cromatografía sobre determinación gravimétrica es que la cromatografía se proporciona información acerca de la composición de ácidos grasos.
Otra alternativa a la aplicación de este método se presenta es 16,19,20 transesterificación directa.En este método de extracción de lípidos y la transesterificación de los ácidos grasos a FAME se combinan en un solo paso. Este método es más rápido que una etapa de extracción y la transesterificación por separado, pero la combinación de estos pasos limita los disolventes que se pueden utilizar para la extracción. Esto podría influir negativamente en la eficiencia de extracción. Otra ventaja de una etapa de extracción de lípidos y transesterificación separada es que permite para una separación adicional de la clase de lípidos entre estos pasos 1. Esto no es posible cuando se utiliza transesterificación directa.
Otros métodos comúnmente utilizados para determinar el contenido de lípidos en microalgas incluyen la tinción de la biomasa con manchas fluorescentes lipófilos tales como Rojo Nilo o BODIPY y la medición de la señal de fluorescencia 21,22. Una ventaja de estos métodos es que son menos laborioso que los métodos alternativos. Una desventaja de estos métodos es que la respuesta fluorescente es, por diversas razones, variable entre especies, las condiciones de cultivo, clases de lípidos, y los procedimientos analíticos. Como un ejemplo, varias de estas variaciones son causadas por diferencias en la captación del colorante por las microalgas. Por lo tanto, se necesita calibración utilizando otro método cuantitativo, realizado preferentemente para todas las diferentes condiciones de cultivo y etapas de crecimiento. Por último, este método no proporciona información acerca de la composición de ácidos grasos y es menos precisa y reproducible que los métodos cromatográficos basados.
El método que se presenta se basa en el método descrito por Lamers et al. 23 y Santos et al. 24 y también se ha aplicado por varios otros autores 1,25-27. También están disponibles otros métodos que se basan en los mismos principios y podrían proporcionar resultados similares 9,28.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito se puede utilizar para determinar el contenido, así como la composición de ácidos grasos totales presentes en la biomasa de microalgas. Ácidos grasos derivados de todas las clases de lípidos, incluyendo el almacenamiento (TAG), así como los lípidos de membrana (fosfolípidos y glicolípidos), se detectan. Todas las longitudes de cadena y grados de saturación de ácidos grasos que están presentes en las microalgas pueden ser detectados y distinguido. El método se basa en la disrupción mecá…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Una parte de este trabajo fue apoyado financieramente por el Instituto para la Promoción de la Innovación en Ciencia y Tecnología-Estratégico de Investigación Básica (TVN-SBO) Luz solar del proyecto y las células BIOSOLAR. Erik audaces y BackKim Nguyen son reconocidos por su contribución a la optimización del procedimiento golpes de talón.
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
Referências
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