Mikroalglerden yağlı asit içeriği ve bileşimi analizi
Summary
Mekanik hücre bozulması, solvent esaslı lipid ekstraksiyonu, transesterifikasyon ve miktar tayini ve gaz kromatografisi kullanılarak yağ asitlerinin tanımlanması göre mikroalg yağlı asit içeriği ve bileşimin belirlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bir tripentadecanoin iç standart ekstraksiyon ve eksik transesterifikasyon esnasında muhtemel kayıpları telafi etmek için kullanılır.
Abstract
Mikroalg içinde mevcut toplam yağ asitlerinin içerik ve bileşimin belirlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Yağ asitleri mikroalg biyokütle önemli bir bileşeni vardır. Bu yağ asitleri, farklı lipid açil-sınıfları içinde mevcut olabilir. Bunlar taşıma yakıtlar, dökme kimyasallar, nutrasötikler (ω-3 yağ asitleri) ve gıda maddelerinin üretimi için kullanılabilir, çünkü özellikle triaçilgliserol (TAG) olarak mevcut olan yağ asitleri, ticari ilgi çekmektedir. Ticari uygulamaları geliştirmek için, yağlı asit içeriği ve bileşimin ölçülmesi için güvenilir analitik yöntemlere ihtiyaç vardır. Mikroalg katı bir hücre duvarı ile çevrelenmiş bir hücrelerdir. Bir yağ asidi analizi yöntemi tüm asil lipidler ve kullanılan ekstraksiyon prosedürü tüm asil lipit sınıfları ayıklamak gerekir kurtarmak yeterli hücre parçalanmasından sağlamalıdır.
Burada sunulan yöntem ile mikroalg içinde mevcut bütün yağ asitlerinin kimliklerini, doğru ve tekrarlanabilir bir olabilir,tified ve zincir uzunluğu, doymamışlık derecesi veya lipit sınıfının parçası oldukları bağımsız numunenin küçük miktarlarda (5 mg) kullanılarak değerlendirilmiştir.
Bu yöntem, farklı lipid sınıfların görece bolluğu hakkında bilgi sağlamaz, ancak birbirinden lipit sınıfları ayırmak için uzatılabilir.
Yöntem, mekanik hücre bozulması, solvent bazlı lipid ekstraksiyonu, yağlı asit metil esterleri (FAME) için yağlı asitlerin esterlenmesi ve miktar tayini ve gaz kromatografisi (GC-FID) kullanılarak FAME tanımlanması bir dizi dayanmaktadır. TAG bir iç standart (tripentadecanoin) çıkarma ve eksik transesterifikasyon esnasında zararları düzeltmek için önce analitik prosedüre eklenir.
Introduction
Yağ asitleri mikroalg biyokütlenin en önemli bileşenlerinden biri olan ve tipik olarak hücre kuru ağırlığına 1-3 5-50% arasında oluşturan bulunmaktadır. Bunlar gliserolipidler şeklinde esas almaktadır. Bu da bu gliserolipidleri esas fosfolipidler, glikolipidler ve triaçilgliserol (TAG) oluşur. Bunlar taşıma yakıtlar, dökme kimyasallar, nutrasötikler (ω-3 yağ asitleri) ve gıda maddelerinin 3-6 üretimi için bir kaynak olarak kullanılabilir, çünkü özellikle TAG içinde mevcut olan yağ asitleri, ticari ilgi çekmektedir. Mikroalg, deniz suyu bazlı ekimi medya büyüyebilir karasal bitkilerin çok daha yüksek bir alansal verimlilik olabilir, ve hatta deniz, tarım için uygun olmayan yerlerde fotobiyoreaktörler ekili olabilir. Bu nedenlerden dolayı, genellikle mikroalg biyodizel ve dökme ürünler 3-6 üretimi için karasal bitkiler için umut verici bir alternatif olarak kabul edilir. Potansiyel hiçbir tarım lve veya tatlı su (kapalı fotobiyoreaktörler veya zaman içinde yetiştirilmiş deniz mikroalglanmn kullanılır) kendi üretimi için gereklidir. Bu nedenle, microalglerin türetilmiş biyoyakıt 3. nesil biyoyakıt olarak kabul edilir.
Yağ asitleri (kuru ağırlık% 'si), lipid sınıf bileşimin, hem de yağ asidi uzunluk ve doyma derecesi toplam hücre içeriği mikroalg türler arasında oldukça değişkendir. Ayrıca, bu gibi besin özellikleri, sıcaklık, pH, ve ışık yoğunluğu gibi 1,2 yetiştirme koşullarına göre değişir. Azot açlık maruz kaldığında, örneğin, mikroalg TAG büyük miktarlarda birikebilir. Optimal gelişim koşulları altında TAG genellikle kuru ağırlığının en az% 2'sini oluşturur, ancak azot açlık TAG içeriğine maruz mikroalg kuru ağırlığının 1 ile% 40 kadar artırabilir.
Mikroalg esas olarak 16 ve 18 arasında zincir uzunlukları olan yağlı asitlerin üretilmesiC-atomlu sikloalkil, ancak bazı türler uzunluğunda en çok 24 karbon atomlu yağ asitleri yapabilir. Yüksek ölçüde doymamış yağ asitleri mikroalg tarafından üretilen her iki yanı sıra, doymuş. 6 (dokosaheksaenoik asit, DHA) hiç bitkisel alternatifler 1,2,4,7 mevcut olduğu için: ve C22 5 (EPA eikosapentaenoik asit): Bu ikinci C20 gibi besin yararları (ω-3 yağ asitleri) olan yağ asitleri içerir. Yağ asidi zincir uzunluğu ve doygunluk derecesi (dağılımı) aynı zamanda yosun kaynaklı biyoyakıt ve yemeklik yağların 4,8 özelliklerini ve kalitesini belirler.
Mikroalg türetilen yağlı asitlerin ticari uygulamaları geliştirmek için, yağlı asit içeriği ve bileşimin ölçülmesi için güvenilir analitik yöntemlere ihtiyaç vardır.
Olarak da Ryckebosch ark. Tarafından 9 işaret, microalglerin yağ asitlerinin analizi (örneğin bitkisel yağ, gıda ürünleri vb hayvansal dokular) olmak başka yüzeylerde ayrılıyorneden 1) mikroalgler lipid ekstraksiyon zorlaştıran, sert hücre duvarları ile çevrili tek hücrelerdir; 2) mikroalgler lipit sınıfları geniş bir yelpazede içerir ve lipit sınıf dağılımı 7 derece değişkendir. Bu farklı lipit sınıfları, kimyasal yapısı ve bu gibi polarite özellikleri geniş bir çeşitlilik vardır. Aynı zamanda, lipid asil başka lipit sınıfları üretilmektedir, 3) mikroalg uzunluğu 12-24 karbon atomu arasında değişen ve her iki doymuş hem de yüksek ölçüde doymamış yağ asitleri ihtiva eden, yağlı asitler geniş bir yelpazede içerir. Bu nedenle, başka alt-tabakalar mikroalg yağ asitleri analiz etmek için geliştirilen yöntemler, mikroalg yağ asitleri analiz etmek için uygun olmayabilir.
Ryckebosch et al. 9 tarafından gözden olarak, yaygın olarak kullanılan lipid ekstraksiyon işlemleri arasındaki temel fark, kullanılan çözücü sistemleri bulunmaktadır. Çünkü mikroalg mevcut lipid sınıfların geniş çeşitliliği, her bir kutup arasında değişen, ekstraktlipid miktarı 10-12 kullanılan çözücülerin göre değişir. Bu durum, lipid içeriğine ve kompozisyon literatür 9,10 sunulan tutarsızlık yol açar. Kullanılan çözücü sistemine bağlı olarak, üzerinden hücre bozulma olmadan solvent ekstraksiyon işlemlerinde kullanılan yöntemler, örneğin, boncuk dayak veya ultrasonik titreşim nedeniyle bir mikroalg türlerinin 9,13 bükülmez yapının tüm lipidlerin çıkarılmasına olabilir. Eksik lipid ekstraksiyon yapılması halinde ise, farklı lipid sınıfların ekstraksiyon verimi 14 değişebilir. Yağ asidi bileşimi, lipit sınıfları 7 arasındaki değişken olduğu için bu, aynı zamanda, ölçülen yağlı asit bileşimi üzerinde bir etkisi olabilir.
Önerilen yöntem, mekanik hücre bozulması, lipid bazlı solvent ekstraksiyon, yağlı asit metil esterleri (FAME) için yağlı asitlerin esterlenmesi ve miktar ve bir alev ioniza ile bir arada gaz kromatografisini kullanarak FAME tanımlanması bir dizi dayanırtion dedektörü (GC-FID). Bir triaçilgliserol (tripentadecanoin) şeklinde bir iç standart önce analitik prosedüre eklenir. Ekstraksiyon ve eksik transesterifikasyon esnasında olası zararlar daha sonra düzeltilebilir. Bir yöntem olup, içeriğinin belirlenmesi hem de mikroalg biyokütle içinde mevcut olan yağlı asitlerin bileşim için kullanılabilir. Depolama (TAG) da dahil olmak üzere hem de membran lipitleri (glikolipitler, fosfolipitler) tespit edilir, örnek yalnızca küçük miktarda (5 mg) kullanılarak belirlendi ve bu yöntem ile, doğru ve tekrarlanabilir bir miktarı, farklı lipid açil-sınıfları içinde mevcut bütün yağ asitlerinin . Bu yöntem, farklı lipid sınıfların görece bolluğu hakkında bilgi sağlamaz. Bununla birlikte, bu yöntem birbirini 1 lipit sınıfları ayırmak için uzatılabilir. Farklı sınıfların lipid konsantrasyonu ve yağlı asit bileşimi daha sonra ayrı ayrı tespit edilebilir.
Literatürde birçok yöntem vardırmikroalg lipitlerini analiz etmek için tarif edildiği. Diğer yöntemler, toplam yağ asitleri 9,16 odaklanmak oysa Bazı yöntemler, toplam lipofilik bileşenlerin 15. odaklanmak. Bu alternatifler çıkarılan toplam lipidlerin gravimetrik belirlenmesi, kromatografisi kullanılarak miktar ile birlikte yağ asitlerinin doğrudan trans-esterleştirme ve lipofilik florasan boyalarla boyanan hücreleri içerir.
Kromatografisi ile yağ asitlerinin miktarının için genel olarak kullanılan bir alternatif, bir gravimetrik belirlenmesi 17,18 kullanılarak lipidlerin miktar olduğunu. Çünkü standart analitik donanımları (örn. Soklet) kullanılabilirliği, prosedürü kurmak kolay,, bir gravimetrik tayini Avantajları gazkromatograf'ın gibi gelişmiş ve pahalı ekipman için şartların eksikliği ve bir gravimetrik tayini daha az zaman harcayarak daha kromatografi yöntemleri göre. Oth üzerinde kromatografi dayalı yöntemler kullanmanın büyük avantajıer el Böyle bir yöntemde, sadece yağ asitleri ölçülür olmasıdır. Gravimetrik belirlenmesinde pigmentler veya steroidler gibi lipidler içeren non-yağlı asit, aynı zamanda belirlenmesi dahildir. Bu non-yağ asidi içeren lipidler toplam lipidlerin büyük bir oranda (>% 50) kadar yapabilirsiniz. On (biyodizel uygulamaları için örneğin) yağlı asit içeriğinin sadece ilgi ise, bir gravimetrik belirlenmesi kullanıldığı zaman, bu fazla tahmin edilecektir. Buna ek olarak, bir gravimetrik belirlenmesi ekstre lipidlerin tartmak için kullanılan analitik denge hassasiyeti kullanılması gereken örnek boyutunu belirler. Bu miktar genellikle kromatografisi kullanıldığında gereken miktarın çok daha fazladır. Son olarak, gravimetrik belirlenmesi üzerinde kromatografisi kullanmanın diğer bir avantajı kromatografisi yağ asidi bileşimi hakkında bilgi sağlamasıdır.
Bizim sunulan yöntemin bir başka alternatif doğrudan transesterifikasyon 16,19,20 olduğunu.Bu yöntemde FAME lipid ekstraksiyonu ve yağlı asitlerin transesterifikasyon bir aşamada birleştirilir. Bu yöntem, ayrı bir çıkarma ve transesterifikasyon aşamasından daha hızlı, ancak şu adımları birleştirme ekstre için kullanılabilir çözücüler sınırlar. Bu olumsuz ekstraksiyon verimini etkileyebilir. Ayrı bir lipid ekstraksiyonu ve transesterifikasyon aşamasından bir başka avantajı, bu adımlardan 1 arasında ek lipid sınıfı ayrılması için izin vermektedir. Doğrudan transesterifikasyon kullanıldığı zaman bu mümkün değildir.
Mikroalg lipid içeriğini belirlemek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemler, Nil gibi lipofilik floresan boyalar ile biyokütleyi boyama dahil kırmızı ya da BODIPY ve floresans sinyali 21,22 ölçülmesi. Bu yöntemlerin bir avantajı, diğer yöntemlere göre daha az zahmetli olmasıdır. Bu yöntemlerin bir dezavantajı, floresan tepkisi, çeşitli nedenlerle, değişkendir, belli coğrafi arasında olmasıdıres, yetiştirme koşulları, lipit sınıfları, ve analitik prosedürler. Bir örnek olarak, bu varyasyonların birkaç mikroalg ile boya alımından farklılıklardan kaynaklanır. Başka bir nicel bir yöntem kullanılarak kalibrasyon bu nedenle tercihen tüm farklı yetiştirme koşulları ve büyüme aşamaları için gerçekleştirilen gereklidir. Son olarak, bu yöntem, yağ asidi bileşimi hakkında bilgi vermek ve kromatografi göre yöntemlerden daha az hassas ve tekrarlanabilir değildir.
Sunulan yöntem Lamers et al. 23 ve Santos ve arkadaşları. 24 tarafından tarif edilen yönteme göre ve aynı zamanda diğer çeşitli yazarlar tarafından 1,25-27 uygulanmıştır. Ayrıca diğer yöntemler aynı ilkelere dayalı olduğunu mevcuttur ve benzer sonuçlar 9,28 sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarif edilen yöntem olup, içeriğinin belirlenmesi hem de mikroalg biyokütle içinde mevcut toplam yağ asitlerinin bileşim için kullanılabilir. Depolama (TAG) da dahil olmak üzere hem de membran lipitleri (fosfolipidler ve glikolipidler) tüm lipit sınıfları, elde edilen yağ asitleri, tespit edilir. Mikroalg mevcut doygunluk her yağlı asit zincir uzunlukları ve dereceleri tespit ve ayırt edilebilir. Yöntem, mekanik hücre bozulması, solvent bazlı lipid ekstraksiyonu, FAME yağlı asitlerin esterlenmes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın bir kısmı maddi Bilim ve Teknoloji-Stratejik Temel Araştırma (IWT-SBO) projesi Güneş ışığı ve Biosolar hücreler tarafından İnovasyon Teşvik Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Erik Cesur ve BackKim Nguyen boncuk atan prosedürün optimizasyonu katkılarından dolayı kabul edilmiştir.
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
Referências
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
- Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
- Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
- Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
- Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 89 (2), 189-198 (2011).
- Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
- Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
- Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
- Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, 75-77 (2010).
- Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
- Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
- Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
- Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
- Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
- Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing “green oil” in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
- Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
- Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
- Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
- Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
- Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
- Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
